λ噬菌體載體DNA的堿性磷酸酶處理實驗

噬菌體 T4 DNA 連接酶 牛小腸堿性磷酸酶 去磷酸緩沖液 蛋白酶 K 限制性內切核酸酶 λ 噬菌體 DNA λ 噬菌體包裝混合物

λ 復性緩沖液 氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 SDS 乙酸鈉 TE Tris-Cl

狗腳指甲鉗 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) λ 復性緩沖液

100 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6)

10 mmol/L MgCl₂

(2) ATP ( 10 mmol/L)

(3) 氯仿

(4) EDTA ( 0.5 mmol/L，pH 8.0)

(5) 乙醇

(6) 酚：氯仿（1:1，V/V)

(7) SDS (10%，m/V)

(8) 乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2 和 pH 7.0)

(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

(10) Tris-Cl (10 mmol/L，pH 8.3)

2. 酶和緩沖液

噬菌體 T4 DNA 連接酶

牛小腸堿性磷酸酶

10X 去磷酸緩沖液（100 mrnol/L Tris-Cl (pH8.3)，10 mmol/L ZnCl₂，10 mmol/L MgCl₂）

蛋白酶 K

限制性內切核酸酶

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌體 DNA

4. 專用設備

狗腳指甲鉗（dog toe-nail clipper) 或寬口尖頭

預置于 16℃、42℃、56℃、68℃ 的水浴

5. 載體和菌株

λ 噬菌體包裝混合物

二、方法

1. 將 50~60 μg 適宜的 λ 噬菌體載體 DNA 溶解于 λ 復性緩沖液中，終體積為 150 μl。42℃ 溫育 1 h，使含有 cos 位點的病毒 DNA 末端復性。

2. 加入 20 μl 10X 連接酶緩沖液，20 μl 10 mmol/L ATP（如果必要），以及 0.2~0.5 Weiss 單位的 T4 DNA 連接酶/μg DNA，16℃ 溫育 1~2 h。

3. 用酚：氯仿抽提連接反應。

4. 微量離心機中室溫離心 1 min 以分離有機相和親水相，將含病毒 DNA 的親水相轉移至一新離心管中。轉移過程用配有一次性尖頭的自動移液設備來完成，而這些尖頭已用狗腳指甲鉗剪斷以增加孔徑。

5. 經標準的乙醇沉淀回收 DNA，然后沉淀用 1 ml 70% 乙醇進行洗滌并離心 2 min。除去上清--70% 的乙醇，將打開的離心管置于實驗臺上，使乙醇揮發，然后將 DNA 沉淀重新溶解于 150 μl TE ( pH 8.0) 中。

6. 用一種或多種限制酶消化。

7. 重復步驟 3 和 4。

8. 加 0.1 倍體積的 3 mol/L 乙酸鈉（pH 7.0）和 2 倍體積的乙醇，4℃ 離心 10 min 以回收 DNA，用 1 ml 70% 乙醇洗滌，再離心 2 min，去掉乙醇，將離心管敞口置于實驗臺上使殘余乙醇揮發。

9. 將上述 DNA 沉淀溶解于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3) 中，終濃度為 100 μg/ml。取一 0.2 μg 的 DNA 組分，置冰浴保存，余下的按下面所述用過量的 CIF 37℃ 作用 1 h：

(1) 加入 0.1 倍體積的 10X 去磷酸緩沖液和每 10 μg λ 噬菌體 DNA 加 0.01 單位 CIP。

(2) 混勻，37℃ 溫育 30 min，加另一份 CIP，繼續溫育 30 min。

10. 加入 SDS 和 EDTA ( pH 8.0) 至終濃度分別為 0.5% 和 5 mmol/L，用輕微渦旋振蕩混勻溶液，加蛋白酶 K 至終濃度 100 μg/ml，56℃ 溫育 30 min。

11. 冷卻至室溫，用酚：氯仿和氯仿各抽提一次以純化 DNA，在 0.3 mol/L 乙酸鈉 (pH 7.0) 存在的條件下，用乙醇沉淀以回收 DNA。

12. 將 DNA 溶解于 TE ( pH 7.6)，濃度為 300~500 μg/ml，隨后將此去磷酸化 DNA 分成多個 1~5 μg 的組分，保存于 -20℃。

13. 通過連接 CIP 處理前后的消化載體組分（0.2 μg) 以測定去磷酸化的效率。將 DNA 包裝入噬菌體顆粒，測定感染滴度。

磷酸酶處理將導致噬菌體臂的連接和包裝效率降低 2~3 個數量級。