《細胞報告》：從“體內”喚醒“寂靜”的基因

　　聽力殘疾位居我國各類殘疾之首，其中60%的耳聾由遺傳因素引起。基因治療是治療基因突變導致的遺傳性耳聾的金鑰匙，尤其是針對DNA的基因修復，更是被給予“治本”的希望。

　　7月12日，《細胞報告》發表了北京腦科學與類腦研究中心研究員（原清華大學生命學院副教授）熊巍團隊與合作者的最新進展，他們首次在哺乳動物模型上展示了利用非同源末端連接（NHEJ）的基因修復通路有效實現先天性遺傳疾病的在體基因治療。

　　從治標到治本

　　據世界衛生組織官網數據，全球大約有4.66億人患有殘疾性聽力損失，其中兒童約為3400萬。

　　臨床上對于遺傳性耳聾的治療，主要是植入人工耳蝸和佩戴助聽器，以及化學藥物治療，但這些都不能從根本上治療耳聾。

　　基因藥是繼化學藥之后的基礎和臨床各機構研發的下一代藥物的重點方向，在人體基因遞送和基因表達等技術門檻陸續解決的情況下，遺傳性疾病的基因治療的前景越來越明確。

　　雖然基因治療被看作治療基因突變導致的遺傳性疾病的“救星”，但目前大部分研究工作集中在針對mRNA的基因替代或者基因沉默。

　　熊巍在接受《中國科學報》采訪時說，基于mRNA的基因治療，雖然若干適用性好的靶基因已經被用于臨床，體現出基因治療的可行性，但就中心法則而言，在mRNA水平的修復還是治標不治本，針對DNA的基因修復是下一代基因治療的新方向。

　　他解釋說，DNA好比是生命的“源代碼”，mRNA等是由DNA轉錄的“產物”，就遺傳突變導致的疾病而言，針對mRNA的基因替代或者基因沉默只是對“產物”的治療。其中基因替代主要是對突變基因做加法，把原突變基因導致功能喪失，通過外源補充野生型基因來替代；基因沉默則是做減法，把致病突變基因消除掉。

　　在他看來，針對mRNA的基因治療不受身體內源調控，具有瞬時性，超過一定時效就會“失效”。

　　“面向DNA的基因編輯帶來的基因修復，可以讓被修復基因跟隨生命體的生長節奏在時間上和空間上實現內源表達調控，是最自然的基因表達和調控的體現，也是最理想的針對遺傳性疾病的修復方式。”熊巍說。

　　經過近7年的研究，熊巍團隊終于提出了特別針對DNA移碼突變的一個方案，并系統展示了在耳蝸毛細胞DNA水平的基因編輯有效恢復動物聽覺。

　　他們還在體外組織和在體動物兩個層面，從編輯基因產物、蛋白表達、毛細胞功能、以及動物生理功能等多個角度的分析和評估來展現該方案的可行性。

　　從體外走向體內

　　近年來，越來越多的科研工作者投身基因編輯技術的探索，但基于基因編輯技術的在體基因治療方案一直處于實驗室和細胞系體系研究階段。

　　熊巍告訴記者，DNA水平的基因修復需要依靠CRISPR-Cas為代表的基因編輯技術，隨著2011年CRISPR-Cas工具的開發成熟，研究者可以依賴guide RNA（gRNA）實現穩定可控的定點DNA雙鏈切割/斷裂（DSB）。

　　DSB的修復有很多通路，其中最主要的是非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復（HDR）兩種。NHEJ產物攜帶各種插入或者缺失（InDel）導致的移碼突變，它的結果等同于從一個突變到多種突變，因此沒有得到基因治療的很好應用。

　　而依賴HDR修復通路是將靶基因修復為野生型，但是這一過程需要有一個野生型的DNA模板，然而在體情況下基于HDR通路的修復效率在活體動物的終端分化細胞上效率非常低，這在一定程度上限制了基因編輯在基因治療上的應用。

　　自2016年以來，陸續有基于細胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割產生的DSB的末端連接產物并非隨機，而是可以預測和重復實現的。

　　“基于這一原理，對于某一個gRNA所獲得DNA編輯事件可以預測，反過來說，也可以根據DNA產物需要來選擇gRNA。但是這個規律在體內的實際情況怎樣還不知道。” 熊巍說。

　　在這項研究中，他們利用一株模擬人類DFNB23遺傳性耳聾的Pcdh15av-3j小鼠品系，全方位系統地展示了突變位點附近產生的DSB可以通過NHEJ通路實現移碼突變的修復以及聽覺和平衡覺功能的部分修復。

　　這項研究涉及組織和在體動物兩個層面的驗證。對于組織層面而言，耳蝸毛細胞的基因遞送一直是一個難點。

　　2014年，熊巍團隊開發了一套耳蝸組織培養和基因電轉遞送的系統解決方案，在此基礎上，他們首先掃描了av-3j突變（1bp插入）上下游15bp的區域內的4條gRNA所產生的編輯產物，發現其中的m-3j-gRNA1表現出高比例的1bp刪除的編輯產物，而且重復性很高，這意味著m-3j-gRNA1是一個潛在的治療av-3j突變的備選gRNA。

　　在培養的Pcdh15av-3j耳蝸組織上，他們又通過電轉表達了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15av-3j毛細胞可以恢復PCDH15蛋白的表達，同時Pcdh15av-3j毛細胞的機械轉導功能也有所恢復。

　　論文的共同第一作者，已畢業的清華大學博士劉戀告訴記者，根據體外研究的效果，團隊又進一步開展了在體動物層面的實驗，對Pcdh15av-3j小鼠在體耳蝸注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。

　　通過對電轉耳蝸組織（體外）和病毒注射耳蝸組織（在體）的基因編輯產物進行的系統比對，發現它們無論是在主編輯產物還是產物的比例上均非常一致。

　　他們又進一步對m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指標進行評估，包括耳蝸毛細胞的PCDH15表達、耳蝸毛細胞的機械轉導電流、小鼠的聽性腦干電位和驚嚇反應等，均顯示單個m-3j-gRNA1在spCas9的幫助下即可實現av3j突變的功能性恢復。

　　這項利用小鼠耳蝸培養組織驗證了終端分化的功能細胞上編輯產物也具有可重復性，并利用該原理實現了單個gRNA即可修復移碼突變，實現小鼠的在體基因治療。概念的成功驗證提示了占人類22%的移碼突變導致的遺傳性疾病有廣闊的治療前景。

　　“腳踏實地”地推進科學研究

　　從2015年在清華大學成立神經通訊實驗室，熊巍就開始帶領團隊研究耳聾相關基因的生理和病理機制，也經歷了“白手起家”的不易。

　　除了所有的技術和資源要從零開始積累，期間更是嘗試了各種策略和方法，最終鎖定利用到NHEJ的非隨機修復機制來重塑移碼突變導致的致聾突變。