一、二、三、四代測序技術原理詳解

　　測序技術的發展主要基于兩個非常具有里程碑意義的理念：“生命是序列的”和“生命是數據的”。序列是基因組學最基本最重要的數據，也是生命科學領域大數據時代的核心組成部分。簡單來說，測序技術就是將DNA/RNA分子中堿基ATGC的排列順序顯示出來。

　　1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構。

　　DNA雙螺旋模型以及“生命是序列的”觀點的發表，直接推動了測序技術的發展，因為解讀生命遺傳信息的前提就是得到它的載體——序列。

　　從20世紀70年代到現在有很多測序技術和平臺的產生，其中包括SBC法、454、Ion Torrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、Nanopore等。今天主要跟大家分享后四種常用的測序技術。

第一代測序技術

　　Sanger法是基于DNA合成反應的測序技術，又稱為SBS法、末端終止法。1975年由Sanger提出，并于1977發表第一個完整的生物體基因組序列。

　　核心原理：由于雙脫氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脫氧，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影，根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。

　　在每個反應體系中，ddNTP相對于dNTP是很少的，所以只有部分新鏈在不同的位置特異性終止，最終就會得到一系列長度不一的序列。

第二代測序技術

　　以Illumina平臺為代表的第二代測序技術實現了高通量測序，有了革命性進展，使得大規模并行測序成為現實，極大推動了生命科學領域基因組學的發展。Illumina循環SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆終止)的核心技術是DNA合成的可逆性末端循環，即3'-OH可逆性的修飾和去修飾。

　　基本原理：將dNTP的3'-OH以疊氮集團RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基團)進行修飾；將4種堿基分別與不同的熒光分子連接；DNA合成時，RTG能起到類似于ddNTP的作用終止反應；每次合成反應終止并讀取信號之后，洗脫RTG和熒光分子，進行下一輪循環。

　　主要過程：

　　a, DNA待測文庫構建

　　利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構建出單鏈DNA文庫。這些文庫中的DNA在通過flowcell(吸附流動DNA片段的槽道)時會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對，并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。

　　b,c 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增。經過不斷的擴增和變性循環，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多份拷貝，進行這一過程的目的在于實現將堿基信號強度放大，以達到測序所需的信號要求。

第三代測序技術

　　以Pacbio平臺為代表的SMRT(Single-Molecule Real Time Sequencing,單分子實時測序)測序技術具有高通量、長讀長的特點。

　　基本原理：Pacbio仍然采用邊合成邊測序的原理，但實現了兩個重要的技術突破。一個是將熒光分子標記在磷酸上，這樣在反應停止且捕獲熒光信號以后，可直接隨磷酸基團脫落，解決了因噪音污染導致的讀長很短的問題；二是由于不需要PCR擴增，信號的有效提取成為了關鍵。通過引入零模波導孔（ZMW）技術解決這一問題。在納米室底部有一個孔徑70nm的小孔，由于遠遠小于激光的波長，所以激光從底部照射時，只會照亮一個小的區域，提高了信噪比。

　　主要過程：如下圖所示，類似于Illumina部分展示的模式圖，也是邊合成邊測序。

第四代測序技術

　　納米孔測序技術是單分子實時測序的新一代技術，主要是通過ssDNA或RNA模板分子通過納米孔而帶來的“電信號”變化推測堿基組成進行實時測序。

　　基本原理：當納米孔充滿導電液時，兩端加上一定電壓，分子模板通過納米孔生成可測量電流。納米孔的直徑只能容納一個核苷酸，單鏈模板就會在電場作用下依次通過納米孔而引起電流強度變化，通過檢測相應的電流峰判斷堿基，實現實時測序。

四大測序技術的優缺點：

　　Sanger法測序讀長長、準確度高，但是通量不高；

　　Illumina測序讀長短、通量高、準確度高，在進行基因組組裝或者結構變異分析的時候沒有優勢，可用作三四代測序read的糾錯；

　　Pacbio測序讀長長、通量高、準確度不高，但可通過測序深度彌補，GC偏差低，可進行甲基化的直接測序。

　　Nanopore測序讀長長、通量高、準確度低，不可通過測序深度彌補，但可通過Illumina read 糾錯。

　　第一、二、三代測序技術都是基于邊合成邊測序的原理，因此Nanopore技術被一些人稱為第四代測序技術；