一代測序、二代測序及三代測序的應用對比

　　一、初現廬山真面目

　　一代測序：又稱Sanger測序(多分子，單克隆)

　　歷史：第一代DNA測序技術(又稱Sanger測序)在1975年，由Sanger等人開創，并在1977年完成第一個基因組序列(噬菌體X174)，全長5375個堿基。研究人員經過30年的實踐并對技術及測序策略的不斷改進(如使用了不同策略的作圖法、鳥槍法)，2001年完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎。

　　原理：在4個DNA合成反應體系(含dNTP)中分別加入一定比例帶有標記的ddNTP(分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP)，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應。

　　二、江山輩有人才出

　　二代測序：NGS技術(多分子，多克隆)

　　背景：Sanger測序雖讀長較長、準確性高，但其測序成本高通量低等缺點，使得de novo測序、轉錄組測序等應用難以普及。經過數據不斷的技術開發和改進，以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa，Hiseq技術，ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技術近年來也殺入歷史舞臺。

　　1、Illumina 原理：

　　橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

　　主要步驟：

　　①DNA文庫制備——超聲打斷加接頭

　　②Flowcell——吸附流動DNA片段

　　③橋式PCR擴增與變性——放大信號

　　④測序——測序堿基轉化為光學信號

　　優勢劣勢：Illumina的這種測序技術每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換。而讀長短(200bp-500bp)也讓其應用有所局限。

　　2、Roche 454

　　油包水PCR + 4種dNTP車輪大戰 + 檢測焦磷酸水解發光

　　主要步驟：

　　①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭

　　②乳液PCR——注水入油獨立PCR

　　③焦磷酸測序——磁珠入孔，焦磷酸信號轉化為光學信號

　　優勢劣勢：454技術優勢測序讀長較長，平均可達400bp，缺點是無法準確測量類似于PolyA的情況時，測序反應會一次加入多個T，可能導致結果不準確。也正是由于這一原因，454技術會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。

　　3、Ion Torrent 原理

　　油包水PCR + 4種dNTP車輪大戰 + 微電極PH檢測

　　主要步驟：

　　①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭

　　②乳液PCR——注水入油獨立PCR

　　③微電極pH檢測——磁珠入池記錄pH

　　優勢劣勢：Ion Torrent與454相比，主要差異在測序中，Ion Torrent不需要昂貴的物理成像設備，成本相對較低體積較小，同時操作更為簡單，整個上機測序可在2-3.5小時內完成(文庫構建時間除外)。其劣勢在于芯片的通量并不高，非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。

　　小結：二代測序相比一代測序大幅降低了成本，保持了較高準確性，并且大幅降低了測序時間，將一個人類基因組從3年降為1周以內，但在序列讀長方面比起第一代測序技術則要短很多，這也給三代測序提供了發展空間。

　　三、獨辟蹊徑補空缺

　　三代測序：單分子測序

　　背景：測序技術經過第一代、第二代的發展，讀長從一代測序的近1000bp，降到了二代測序的幾百bp，通量和速度大幅提升，那么第三代測序的發展思路在于保持二代測序的速度和通量優勢同時，彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比，最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。

　　1、Oxford nanopore

　　納米孔 + 電流檢測技術

　　原理：該技術設計了一種特殊的納米孔，孔內共價結合有分子接頭，最終得到電信號而不是光信號或pH信號的測序技術。當DNA堿基通過納米孔時，電荷將發生變化，因而短暫地影響流過納米孔的電流強度(每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的)，靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。

　　優勢劣勢：

　　①讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb；

　　②錯誤率目前相比較高，且是隨機錯誤，而不是聚集在讀取的兩端；

　　③數據可實時讀取；

　　④通量很高(30x人類基因組有望在一天內完成)；

　　⑤起始DNA在測序過程中不被破壞；

　　⑥樣品制備簡單又便宜；

　　⑦可直接測序RNA。

　　2、PacBio SMRT

　　納米孔 + 熒光可逆終止dNTP技術

　　原理：PacBio SMRT技術其實是應用了邊合成邊測序的思想(使用4色熒光標記 4 種堿基)，其超長讀長的關鍵在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片為測序載體(ZMW原理)。

　　優勢劣勢：

　　①SMRT技術的測序速度很快，每秒約10個dNTP；

　　②錯誤率較高，達到15%，出錯隨機，可通過多次測序來進行有效的糾錯(如使用Sparc對30X的數據進行分析，錯誤率可達到0.5%)；

　　③原始DNA不被破壞；

　　④讀長可達10kbp。

　　3、Helicos Heliscope

　　單分子熒光可逆終止技術

　　原理：該技術基于邊合成邊測序的思想，將DNA隨機打斷成小片段分別進行dNTP熒光標記，經過不斷地重復合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。

　　主要步驟：

　　①制備：DNA打斷加polyA+Cy3

　　②測序：dNTP熒光可逆終止

　　特點：

　　①讀取長度約為30-35 bp，每個循環的數據產出量為21-28 Gb；在測序完成前，各小片段的測序進度不同；

　　②可根據同聚物的合成會導致熒光信號的減弱這一特點來推測同聚物的長度；

　　③可通過二次測序來提高準確度(直接變形洗脫模板)

　　小結：

　　三代測序優勢：

　　①第三代基因測序讀長較長，可以減少拼接成本，節省內存和計算時間；

　　②作用原理上避免了 PCR 擴增引入錯誤；

　　③拓展應用：RNA的序列，甲基化的DNA序列等；

　　三代測序缺陷：

　　①單讀長的錯誤率偏高，需重復測序以糾錯(增加測序成本)；

　　②依賴DNA聚合酶的活性；

　　③成本較高(二代Illumina的測序成本是每100萬個堿基0.05-0.15美元，三代測序成本是每100萬個堿基0.33-1.00美元)。

　　④生信分析軟件不夠豐富、數據積累少。