鐮刀菌為條件致病性真菌，廣泛分布于自然界土壤、植物的地上及地下部分或植物碎片。我國從事農業人口居多，農業性眼外傷多見，為鐮刀菌的角膜種植性感染提供機會。本文介紹1例眼部感染輪枝鐮刀菌的病例。
病歷摘要
患者，男，73歲。2個多月前，勞作時左眼不慎被紅薯藤葉劃傷，4 d后出現左眼紅痛、畏光、流淚、視力下降，伴眼脹痛、異物感，于當地醫院就診，予以抗炎藥物(抗生素滴眼液，具體不詳)對癥治療，效果不明顯。1個月前左眼病情加重，繼續使用抗生素點眼治療無效，為求進一步治療，于 2017年2月9日入住本院眼科。查體:T 36.4 ℃，P 76 次/min，血壓150/90 mmHg。右眼視力.8，左眼視力光感，左眼結膜混合充血、水腫，左眼中央角膜全層浸潤渾濁，衛星灶(見圖1)，顳上、鼻上角膜輕度水腫，角膜內皮斑，前房黏稠積膿，內窺不清。
圖1 左眼中央角膜病灶
入院后根據查體特征，留取眼部分泌物行細菌、真菌培養，并給予左氧氟沙星滴眼液、普拉洛芬滴眼液、氟康唑眼液局部點滴患眼，同時給予氟康唑靜滴等抗炎對癥治療。2月16日行左眼球內容物剜除+義眼植入術，再次留取術中角膜組織行細菌、真菌培養。術后因患者并發冠心病，轉入心內科繼續治療。
病原學檢查
1.直接涂片及細菌真菌培養
入院當日將病灶分泌物拭子直接涂片革蘭染色鏡檢，并接種血瓊脂平板、中國藍瓊脂平板、不含抗生素巧克力瓊脂平板，置35 ℃行細菌培養;接種沙氏瓊脂平板、土豆瓊脂平板，置25 ℃行真菌培養。涂片未見病原菌。血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板培72 h未見病原菌生長，為提高苛養菌的檢出，隨后延長培養至7 d，未見病原菌生長;沙氏瓊脂平板、土豆瓊脂平板培養28 d未見病原菌生長。
手術當日將送檢的角膜組織標本，部分用組織研磨器研磨成勻漿，用以常見細菌(包括苛養菌)、真菌、分枝桿菌的檢出;部分用組織剪剪碎，用以接合菌的檢出。將兩者混合物分別接種血瓊脂平板、厭氧瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、沙氏瓊脂平板、土豆瓊脂平板以及羅氏培養基，并分別制作革蘭染色涂片、抗酸染色涂片以及六胺銀染色涂片各1張。涂片均未見可疑病原菌。72 h后，血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、沙氏瓊脂平板以及土豆瓊脂平板均生長出白色真菌菌落，生長迅速，5 d后，血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板培養菌落呈羊毛狀生長，表面淡黃色(見圖2);沙氏瓊脂平板菌落為羊毛狀，表面淡黃色，邊緣白色，中央黃褐色，背面黃色(見圖3);土豆瓊脂平板菌落為羊毛狀，表面淡黃色，邊緣白色，中央黃褐色(見圖4)。56 d羅氏培養基未見分枝桿菌生長。
圖2 血瓊脂平板5 d菌落形態
圖3 沙氏瓊脂平板5 d菌落形態
圖4 土豆瓊脂平板5 d菌落形態
菌落乳酸酚棉藍染色后鏡檢可見分隔菌絲，產孢細胞為簡單瓶梗。有2類分生孢子:一類無分枝或分枝分生孢子梗上的瓶梗可生成 2～6 μm× 14～80 μm、鐮刀形或獨木舟形的大分生孢子(3～5個隔膜);一類長短不一的簡單分生孢子梗可生成2～4 μm×4～8 μm，卵圓形、單或雙細胞的小分生孢子，其呈單個或成簇聚集(見圖 5)。形態學鑒定為鐮刀菌屬。
圖5 菌落乳酸酚棉藍染色鏡下形態(×400)
2．內轉錄間隔區(ITS)檢測
用Primer Premier引物設計軟件，針對真菌核糖體RNA基因序列設計通用引物，序列分別為ITS1(F):5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4(Ｒ): 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由北京睿博興科公司合成。嚴格按照提取試劑盒(QIAamp DNA MiNi kit，Qiagen 公司) 提取真菌 DNA。ITS PCR擴增體系共25 μL，包括Mix 12.5 μL，100 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，DNA 2 μL，ddH 2O 9.3 μL。PCＲ反應條件:94 ℃變性10 min;94 ℃ 變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物純化后送北京睿博興科公司測序。所測序列在 GenBank 核酸序列數據庫中進行同源序列比對，篩選相似度≥99% 的序列，結果為輪枝鐮刀菌，亦即串珠狀赤霉。
討論
真菌性角膜炎是一種病情嚴重，致盲率高的眼部感染性疾病，其常見致病菌為鐮刀菌，其中以茄病鐮刀菌最為多見，其次為串珠鐮刀菌。該病例患者勞作中左眼被植物藤葉劃傷，經驗抗感染治療無效，眼部檢查左眼中央角膜全層浸潤渾濁、衛星灶，符合眼部真菌感染的流行病學及體格特征。病變組織微生物培養形態學鑒定為鐮刀菌屬，基因測序鑒定為輪枝鐮刀菌。
該病例中患者由于沒有進行及時的抗真菌治療，貽誤了最佳治療時機，采取左眼球內容物剜除+義眼植入術。因此，對于眼部外傷患者，真菌感染需引起高度重視，盡早診斷并給予積極治療是保障患者療效及預后的關鍵因素。資料顯示，鐮刀菌對氟康唑、酮康唑、棘白菌素類藥物天然耐藥。鐮刀菌對兩性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、氟康唑的敏感性分別為94.35%、7.11%、39.39%、82.22%、0.00%。提示在臨床工作中，對于可疑真菌性角膜炎，經驗抗感染治療應覆蓋鐮刀菌。而對于鐮刀菌的治療，應恰當選用兩性霉素 B等藥物，氟康唑可能無效。
該病例中分別送檢患者眼部分泌物拭子及病變角膜組織行微生物培養，患者眼部分泌物拭子培養未見病原菌生長，而病變角膜組織培養出鐮刀菌，分析其原因可能為侵襲性真菌感染中，致病性真菌常侵入組織生長，而分泌物標本中大多為壞死的混合細胞成分，從而使送檢分泌物標本中病原菌檢出率降低。以上說明感染性疾病病原學診斷中送檢組織標本對病原菌診斷的重要性。