一文讓你了解實時熒光定量pcr

　　實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

　　實時熒光定量PCR檢測方法有SYBRGreenⅠ法和TaqMan探針法。

　　SYBRGreenⅠ法是在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

　　TaqMan探針法是在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。

　　在對熒光定量PCR結果進行分析時首先要了解幾個概念：

　　基線（Baseline）指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。

　　光域值threshold的設定，一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數期。

　　CT值表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小，反之亦然。

　　融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。