材料和方法
對照血清(綿羊)和病毒抗原購自英國NIBSC，除了B/Brisbane/3/2007血清和抗原來自荷蘭Solvay Phormaceuticols，PR/B/34血清(雞)和病毒是購自美國Charles River Laboratories。重組的全長HA蛋白(A/H1N1/New Caledonia/2O/99、A/H3N2/Wyaming/3/2003和B/Jilin/20/2003)分別購自以色列PraspecBio、荷蘭Genway和美國Protein Sciences。表4中分析的工藝樣品來自瑞典通用電氣醫療集團，除了B/Brisbane/3/2007 MBV和TBV)樣品以及A/H1N1/Salamon Islands/3/200 TBV樣品是由荷蘭Solvay Pharmaceuticals提供的。三價疫苗購自三家制造商。覆面活性劑P2O(polyoxyethglenesorbitan)、HBS-EP+緩沖液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05％表面活性劑P2O)、氨基偶聯試劑盒、Cy3-染料、瓊脂糖和DNA均來自通用電氣醫療集團。牛血清白蛋白(BSA)購自Pierce，DMEM購自Invitrogen，蔗糖、NaCl和兩性洗滌劑Zwittergent購自默克。
所有分析都使用了Biacore TM l00系統和CMS傳感器芯片(通用電氣醫療集團)。相互作用研究是基于金表面的表面等離子共振檢測，再結合處理試劑的微流體系統。生物分子之間的相互作用以非標記分析形式實時監控。相互作用分子中的一方固定在傳感器表面的半流體葡聚糖基質上。另一個分子隨后注入到流經傳感器表面的溶液中。當注入樣品中的分子與固定在傳感器表面的相互作用配體結合時，即可檢測到SPR響應的變化。響應水平的變化與表面上質量的變化成正比。此方法設定為抑制分析(圖1)，以避免大的病毒分子的擴散影響[28]。樣品無需預處理就能分析。HBS-EP+作為分析緩沖液。采用標準的胺偶聯步驟[29]，注入50-80 ul重組HA(10 ug/ml)從而將重組HA蛋白固定在7000-10000個響應單位(RU)，條件分別為l0 mM馬來酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 6.5)(HA/H1Nl l5分鐘,HA/H3N2 7分鐘),或者在10 mM磷酸緩沖液(含0.05％Surfactant P2O,pH 7.0)。(HA/B 20分鐘)。
對抗流感血清進行滴定，以在400s注射時間內在各自對應的表面上產生700-l400個RU的響應。將病毒參照抗原混合物，或未知濃度的病度樣品，與固定稀釋度的抗流感血清混合，在400s內注入表面。隨后利用50 mM HCl、或者0.05％Surfactant P2O再生表面(30s)。注射樣品中的游離抗體與表面的HA結合。產生響應(圖1)。每次分析時先進行5-10次只有血清和再生步驟的啟動循環，以穩定表面。在每次分析開始、中間和結束時均分析血清和參照抗原的校準曲線。為了在分析過程中根據校準曲線的改變而調整，將三個校準曲線中的四個參數回歸的換算系數用于生物傳感器軟件的原型功能性的標準化。因此每個樣品得到一組獨特的校準曲線系數，用于樣品濃度的計算。
在微滴定板中制備標準品和樣品，樣品體積40-80 ul，分析一股以無人值守的模式過夜運行(96個樣品/標準品約15個小時)。
可靠性測試所使用的添加劑為DNA、BSA、DMEM、蔗糖和NaCl，如表3所示。
在三價分析中，HAA/H1Nl、A/H3N2和B固定在同一塊芯片的三個不同通道中(圖7)。首先將三個特定的參照抗原與血清(A/H1N1/Solomo Islands、A/H3N2/Wiscansin、B/Malaysia)混合，以形成三價的校準曲線抗原和三價血清。樣品隨后穿過三個表面，在一個實驗中同時分析三個毒株。
按照制造商所提供的SRID滴度按比例稀釋血清亞型特異性研究，以評估血清親和力的差異。
圖1. 抑制分析的原理(A和B)。一開始將HA固定在葡聚糖基質上(黑色實心圈)。病毒隨后與固定濃度的血清混合，并注射到表面。游離的抗體(在平衡的不與病毒結合)與表面HA結合，產生響應。樣品中低濃度的病毒(A)產生高的抗體結合，而高病毒濃度(B)產生低的結合水平。(C)疊加圖顯示出注射的血清與系列濃度的病毒標準品混合后的感應圖。在注射前后取報告點(標以X)，并測量這之間的響應水平(箭頭所示)。每次注射后再生表面，為新注射作準備。