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  • 為了擴展特異性研究,對27種不同的血清與固定了HA/H3N2的表面之間的結合進行分析(圖5、表2)。結果顯示只有特異針對H3N2亞型的血清才能與表面明顯結合。抗-B和抗-H1N1血清顯示出低的結合水平。相應地,利用50 mM HCl、0.05% P2O再生后,也開展了27種血清與固定了HA/B和HA/H1N1的表面結合的實驗。結果顯示只有抗-B和抗-H1Nl血清分別明顯結合(數據未顯示)。

     

    圖3定量B/Jiangsu/10/2005的血清響應水平。參照抗原稀釋后,與濃度為0.5-16ug/ml的相應血清混合。在固定了重組HAB的表面上重復分析校準點(實心菱形)、樣品(空心菱形)和對照樣品(6 ug/ml,空心正方形)。計算出的濃度顯示在表1。

     

    圖4流感亞型特異性。在同一實驗中在三個表面A/H3N2(A)、A/H1N1(B)和B(C)上分析不同血清毒株的結合水平。樣品中要么含有血清,要么含有混合了2ug/ml各自參照抗原的血清。

     

        圖5 27種不同血清(表2中詳細說明)在固定了重組HA/H3N2的傳感器芯片上的響應。A/H3N2血清毒株的結合以實心菱形標出,A/H1N1血清毒株以空心菱形標出,B毒株以空心正方形標出。用50 mM HCl和0.05% P2O再生表面。血清1和2重復分析兩次,以監測響應偏差。

        開展初步分析以探索毒株特異性。在固定了重組HAA/H3N2/Wyoming的傳感器芯片上運行校準曲線,該曲線有著標準品和血清的四個可能組合,針對隨機選擇的H3N2毒株Wyoming和New York(圖6A)。最低濃度的響應水平范圍在1700-2000個RU。為了利于比較,將各個曲線的每個響應除以最低濃度(以%表示),來標準化響應。曲線以N.Y/N.Y、N.Y/W、W/W和W/N.Y的順序運行。W/W組合在另一塊有著相似固定水平的芯片上重復運行4次,提供實驗差異的參考數據(圖6B)。結果顯示所有W/W組合的抑制實現了最高的靈敏度。結果還表明,就這兩個毒株而言,如果用New York標準品和血清來定量Wyoming樣品,合獲得過高的計算濃度值。

     

        在疫苗純化過程中,各個步驟的樣品有著不同的純化圖,可能會含有影響濃度分析的化合物。為了研究分析中添加劑的影響,分析前在參照抗原中加入了BSA、-DNA、細胞培養基、蔗糖和鹽。結祟顯示在表3。BSA、-DNA和細胞培養基不影響分析。鹽和蔗糖降低了響應,顯著增加了表觀濃度:然而這些添加劑的影響可用稀釋處理來避免。研究發現1<%的蔗糖和<0.2 M的NaCl對于可靠定量是理想的。還重復運行了含有55 ug/ml純化的A/H1N1/Solomon slond的對照樣品,以研究準確性。在一個分析(一塊芯片/凝膠)內,生物傳感器方法的內部CV為2%(5次重復),而SRID為9%(12次重復)。兩個操作員在不同時間所做的不同分析之間,生物傳感器方法的內部CV為5%(3次分析),而SRID為18%(5次分析)。

    圖6實例顯示固定了重組HA A/H3N2/Wyoming的傳感器芯片上的毒株特異性。用針對兩個H3N2毒株Wyoming和New York的四個標準品和血清的可能組合,運行校準曲線。將各個曲線的每個響應除以最低濃度(以%表示),來標準化響應,便于比較。曲線是以所使用的標準品/血清來命名的,如W/N.Y意味著這條曲線使用了標準品Wyoming和血清NewYork(A)。W/W組合在另一塊有著相似固定水平的芯片上重復運行了4次,提供實驗差異的參考數據(B)。


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