一種快速有效的基因分型斑馬魚的方法（一）

 為了促進斑馬魚的高通量的基因分型，我們開發了一種新的技術——用高通量熔解分析（HRMA）區分野生、雜合、純合突變。這種耗時一個小時的技術不需要進行限制性內切酶酶切和瓊脂糖凝膠電泳的操作。此技術生成的熔解圖的敏感性高，可以檢測不明確的PCR產物。我們可以對斑馬魚的三種類型的突變進行可靠的基因分型，包括apchu745（apcmcr）和p53zy7 （p531166T ），小的缺失突變（bap28y75）及逆轉錄病毒的插入突變（wdr43hi821a）。這種技術可對單個斑馬魚胚胎及個體進行基因分型并適用于其它類型的生物體。Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009?2009 Wiley-Liss，Inc。
關鍵詞：熔解曲線   斑馬魚  基因分型  SNP  點突變  插入突變

簡介
       斑馬魚作為有機體遺傳模型正在成熟。考慮到比較容易維持大量的突變線，且大量的魚位于每個突變線，大規模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技術。突變的多種類型導致斑馬魚突變，增加了基因分型的復雜性。ENU誘變劑——誘導斑馬魚突變的主要物質，經常導致單個堿基的突變，小的缺失插入也會發生。第二種比較普遍的方式是插入誘變，用逆轉錄病毒插入或轉座因子插入破壞基因。因此，有效的基因分型這些突變類型的方法是必須的。
       提供一種更快、有效、令人滿意的基因分型方法，有100%的精確度。尋找高通量的技術/方法，去除掉比較浪費時間的步驟。隨著擴增基因組DNA 的PCR技術的出現，典型的基因分型技術包括Southern印跡法和放射性方法（RFLP和SSCP）已經逐漸被淘汰。一些基于PCR的方法用于偶然產生或消除限制性內切點的突變。大多數方法，除了測序方法之外，需要用PCR產物跑瓊脂糖凝膠電泳。當數百個或成千上萬個樣品需要基因分型時，這項工作就變得浪費時間且費用較高。
       對于產生或消除一個特殊的限制性位點的突變而言，以PCR為基礎的限制性片段長度多態性（RFLP）是一種有用的技術。在這個實驗中，設計PCR引物擴增感興趣的范圍。PCR產物用合適的內切酶消化，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化產物。根據純合突變、雜合突變和純合野生型的限制形式進行基因分型。
       衍生的酶切擴增多態性序列（dsCAPS）與RFLP相似，限制的消化模式用于決定基因型。不同的是在PCR引物中引入多個錯配，所以額外的錯配，在PCR擴增產物中產生一個特殊的限制性位點。接著，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化的PCR產物，再根據相應的限制消化形式進行基因分型。但是這技術有自身的缺點，不完全消化導致的錯誤的基因分型（如：純合突變誤判為雜合突變）。另外，需要的限制性內切酶一般很少且很貴。
        等位基因特異性擴增（ASA）是另外一種基于PCR的方法。進行兩次PCR反應，用2條不同的上游引物，其中一條對野生型等位基因特定的，另外一條是對突變特定的。在這種情況下，一條引物3’端的核苷酸與野生型的點突變相一致，另外一條引物3’端的核苷酸與突變的序列相一致。這種錯配序列的擴增和退火細節取決于這種方法的特異性。這種方法的缺點是，由于PCR過程中的錯誤擴增，造成假陽性的情況比較復雜。
       逆轉錄病毒突變（或插入其他外源DNA序列比如說轉座因子）根據逆轉錄病毒插入位點或野生型DNA的PCR擴增的特異性來進行基因分型。這些PCR反應可以單獨進行，一個反應做野生型等位基因，另外一個做突變，也可以做多重PCR。在這種情況下，用的是同一個上游引物。兩個不同的下游引物，一條退火成逆轉錄病毒DNA，另一條退火成野生型DNA。多重PCR反應中，設計PCR引物，使野生型等位基因和突變型產物大小不同，在瓊脂糖凝膠電泳上可以檢測出來。如果PCR反應成功，純合突變在瓊脂糖凝膠電泳上可見一條突變產物，雜合動物有兩個產物，純合野生型動物可見一個野生型產物。這種技術非常精確，但是因為長的PCR反應而比較浪費時間，另外需要瓊脂糖或其他高分辨的凝膠劑檢測。
        如果沒有提供上述技術，DNA測序也是動物基因分型的一種選擇。在這種情況下，在感興趣范圍的側翼區設計引物，并擴增PCR。通過對PCR產物測序顯示個體動物的基因型。這種分型方法避免了瓊脂糖凝膠電泳的檢測。然而，測序所用的時間及費用是這項技術的缺陷。
        高分辨率熔解曲線分析（HRMA）是分析PCR產物的齊次方法，不需要PCR反應之后的操作。其應用包括篩查突變、基因分型及序列匹配。主要應用于人類，最近報道了這些技術。
       我們開發了一種有效、精確基因分型斑馬魚的方法，可以檢測多種類型的突變。我們用一種快速有效，不需要瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法進行了兩個堿基對的替換、一個缺失和一個逆轉錄病毒的插入的基因分型。這種方法用高分辨率熔解分析方法分離胚胎或個體魚的純合突變，雜合子及純合野生型。

結果
       為了克服現有基因分型技術的缺陷，需要從以下3個方面改進：（1）去掉效率低且昂貴的限制性內切酶。（2）去掉對瓊脂糖凝膠電泳或其他PCR之后操作步驟的需要，但是保持區別非特異性產物的能力。（3）增加目前基因分型的速度。高分辨率熔解曲線分析方法符合上述3個要求。
        HRMA用的是敏感性高的成像儀器（我們實驗用的是Lightscanner），在一定溫度范圍內量化DNA雙鏈。通過使用一種依賴DNA的熒光化學物質——LC Green染料來量化DNA雙鏈，此染料與雙鏈DNA緊密結合且發光。LC Green染料與其它燃料如Sybr-Green 相比，可以用于DNA的飽和濃度而不抑制PCR反應，能夠產生高敏感性的熔解曲線。隨著樣品的加熱，不斷的檢測熒光的發射。一旦達到特定DNA飽和雙鏈的熔解溫度，可以檢測到熒光信號的劇烈下降。獲得派生的熔解曲線，且在y軸描述每單位（-dF/dT）熒光信號隨著橫坐標x軸溫度的增加的的陰性改變。小的變化，甚至是單核苷酸多態性，在DNA雙鏈的熔解溫度上發生改變。在此，我們應用HRMA方法對兩個缺失突變，一個小的缺失和一個病毒插入突變進行分型。
        這種技術不需要限制性內切酶，瓊脂糖凝膠電泳，且因為PCR產物小于60bp，整個PCR反應及熔解分析在1小時之內完成。另外，PCR產物的特異性可以由熔解曲線的一致性決定，比如說，如果在PCR反應中有污染，會顯示額外的熔解峰。提供Lightscanner軟件可在10分鐘內自動分析數據。

單核苷酸多態性（SNP）檢測
       ENU是正向遺傳學通用的誘變劑，ENU引起的最普通的突變是單個堿基對的改變，引起單核苷酸多態性，區分野生型和突變等位基因。我們區分了斑馬魚線的一個p53突變——p53zy7，此突變經由ENU誘變F3正向遺傳學篩查。此突變是T→C轉化在基因的DNA結合范圍生成I166T。因為p53zy7/zy7突變純合突變線是完全可見的且沒有形態學的不同，因此分子基因分型斑馬魚個體是必要的。首先，對包括突變的范圍進行測序是區分基因型唯一可靠的方法。為發展一種高通量的鑒定突變的方法，HRMA開發了針對這些位點進行基因分型的技術。我們用Lightscannrt引物設計軟件設計包括突變位點（Fig.1A）的引物。整個的PCR產物是39個堿基對。一般而言，PCR產物越小，Tm值的差異越大。但是，在點突變或小的缺失的情況下，Tm值的差異受序列改變的較大限制，而不是引物設計。野生型和突變DNA雙鏈的單個堿基對的不同造成野生型和突變等位基因之間的Tm值相差近1.5℃。為了檢測以上所述的情況，我們從雜合交叉的魚個體中準備了48個尾部修飾的DNA樣品。根據這些樣品的PCR產物生成的熔解曲線，我們觀察到純合野生和純合突變的斑馬魚的熔解曲線的形狀不同（Fig.1B）。明顯的，我們的protocol參數允許評價雜合度。PCR程序結束時，加熱樣品至95℃使DNA變性，之后快速冷卻形成異源雙鏈核酸分子。因此，除了有中間的Tm（野生型和突變同源雙鏈之間是～80℃），雜合子有較低的Tm產物，這是因為異源雙鏈的不穩定性。
用另一個錯譯的等位基因驗證這項技術，同時檢測這項技術是否可以有效的用于晶胚的基因分型，我們從側翼設計引物有一個T—C的錯配突變在apchu745（apcmcr）（Hurlstone et al., 2003)。PCR產物是53bp，預計純合野生型和突變之間有Tm值有1.5℃的差異（表1C）。從雜合晶胚中得到48個DNA樣品。再次進行溶解曲線分析，結果產生了三種不同的溶解曲線（表1D）。在這種情況下，該突變等位基因有胞嘧啶核苷酸，因此，有較高的Tm值，因此，雜合樣品產生了一個中間的同源雙鏈峰和一個異源雙鏈峰。