一種新型納流液相色譜柱制備技術

　　隨著人們對生命科學的深入探索，高度復雜的生物樣品對分離分析技術提出了更高的要求，nanoLC-MS（納流液相色譜-質譜聯用）是復雜生物樣品分析的首選方法，但制備高分辨的納流液相色譜柱仍然存在挑戰。傳統的高壓勻漿制柱方法使用填料勻漿液直接進行高壓填充，填充過程中填料易團聚沉降，導致柱床填充不均一，降低色譜柱的柱效和制柱效率（圖1），尤其在長柱制備方面存在較大的技術障礙。雖然已有研究對傳統勻漿填充的實驗參數進行優化，但始終無法從根本上解決這一問題，因此亟需發展新的色譜柱制備技術。

　　圖1. 傳統勻漿法制柱中填料顆粒團聚現象

　　廈門大學化學化工學院的張博課題組前期針對毛細管填充柱的制備和應用開展了一系列研究工作：如長柱制備技術、單顆粒塞技術(Anal. Chim. Acta, 2014, 852, 267-273； J. Chromatogr. A, 2014, 1325, 109-114)，實現了高通量地制備高分辨率、高重現的毛細管色譜填充柱，同時也對不同類型毛細管填充柱的分離性能進行了深入探究(Anal. Chim. Acta, 2015, 863, 86-94； Anal. Chim. Acta, 2018, 1033, 205-212； Anal. Chim. Acta, 2019, 1062, 147-155； J. Chromatogr. A, 2021, 1648, 462218)。在以上研究基礎上，為了消除勻漿填充中填料顆粒團聚沉降帶來的不良影響，并解決長柱填充的困難，結合液滴微流控技術發展了一種新型納流液相色譜柱制備技術（圖2），將液滴作為動態、均一、相互獨立的納升級“勻漿罐”，從根本上解決了填料易團聚沉降的問題，克服了高濃度勻漿液使用時由于填料團聚沉降造成的柱床不均一與空腔問題，大幅提升制柱效率，同時獲得均一緊實的柱床，有利于常規納流液相色譜柱和高分辨納流液相色譜長柱的制備，為復雜生物樣品的高分辨分離需求提供了強有力的分析方法。

　　圖2. 基于液滴微流控的納流液相色譜柱制備示意圖

　　研究過程中，對液滴微流控平臺進行了優化，保證勻漿液滴的長時間穩定生成和收集，對填料顆粒在預組裝液滴中的分布情況（圖3）、柱床形成過程（圖4）、柱床形貌進行了表征（圖5），驗證了這一技術的可行性，并使用此技術成功制備了3 m、5 m、10 m的超長納流液相色譜柱（圖6）。

　　圖3. （A）20、100、180 mg/mL勻漿液液段：填料顆粒24 h呈分散狀態；（B）20 mg/mL勻漿液直接注入毛細管：填料30 min時呈明顯聚集狀態。

　　圖4. 柱床形成過程視頻截圖：填料勻漿液濃度為180 mg/mL，連續相（水相）流經柱床時柱床呈黑色，氯仿流經柱床時柱床呈透光狀態。

　　圖5. 激光共聚焦掃描顯微鏡表征柱床形貌3D圖像：（A）180 mg/mL勻漿液、基于液滴微流控填充的色譜柱；（B）2 mg/mL勻漿液、傳統高壓勻漿法填充的色譜柱。

　　圖6. 基于液滴微流控方法制備的3 m、5 m、10 m超長毛細管填充柱。邊緣整齊的灰色部分為填充的柱床，不平整的黑色部分為毛細管外邊緣。

　　研究表明，基于液滴微流控填充的色譜柱，在高濃度勻漿液180 mg/mL條件下具有更優的動力學性能和更優的復雜生物樣品分析性能：以HeLa細胞蛋白酶解物為樣品，10 cm短柱（填料粒徑5 μm）顯示出與商品化納流柱（Waters，填料粒徑1.7 μm）相當的分析性能，150 cm長柱和500 cm長柱的多肽分離性能顯著提升，150 cm柱鑒定肽段數和蛋白質數分別提升了75.0%和38.4%，500 cm柱鑒定肽段數和蛋白質數分別提升了261.0%和82.3%。以上數據表明長柱具有更高的分辨率，能夠顯著降低質譜對多肽組分的漏檢率，多肽的檢出數量顯著提升，多肽鑒定數和蛋白鑒定數大幅增加，數據的可信度也更高，對于蛋白質組學研究具有重要意義。

　　該工作相關論文近日發表在Analytical Chemistry 上，張博副教授為通訊作者，第一作者是王曉飛博士，朱玨、楊陳渝虎和秦飛為共同作者。