一種適于大鼠牙周膜I型膠原mRNA原位雜交的方法

實驗概要

本實驗方法是選用大鼠為對象建立動物模型，采用地高辛標記的寡核苷酸探針的原位雜交。

實驗步驟

1. 標本制備
選用80只體重為250±20g的雄性Wistar成年大鼠，給大鼠注射過量麻藥后，左心室用4％多聚甲醛灌注。解剖出下頜骨，僅保留磨牙區骨段，浸泡于4％多聚甲醛中再固定6小時。將標本移入脫鈣液(含0.7g/L EDTA，8mg/L 酒石酸鈉鉀，0.14g/L 酒石酸鈉，99.2ml/L HCL)中4℃保存兩周。洗凈脫鈣液，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。每個下頜骨標本切3張組織切片，厚度一律控制為5μm，裱于經硅化處理的玻片上。

2. 探針的制備與標記
采用長度為39個堿基的反意義寡核苷酸探針，序列為：5’-GCC GTC TTC AGA GCT GTA AAC GTG GAG GCA AGG AGT CCC-3’。用地高辛寡核苷酸加尾試劑盒將地高辛精11-dUTP標記到寡核苷酸的3’末端。
3. 原位雜交
   1) 常規二甲苯脫蠟，梯度酒精至水(Depc水)；

   2) 0.2MHC1中浸泡20分鐘，Depc水洗；

   3) 加入50μg/ml蛋白酶K，37℃孵育20分鐘，PBS洗；

   4) 0.2％甘氨酸PBS溶液浸泡20分鐘，PBS洗；

   5) 4％多聚甲醛的PBS溶液后固定20分鐘，PBS洗；

   6) 0.25％乙酸酐、0.1M三乙醇胺溶液浸泡10分鐘，PBS洗；酒精梯度脫水，空氣中干燥1小時；

   7) 準備雜交緩沖液：0.125mg/mlSSDNA、0.25mg/ml tRNA、50％甲酰胺、12.5％硫酸葡聚糖，104℃干浴10分鐘后自然冷卻到室溫，再加入適量DTT，備用；

   8) 將標記好的探針用探針稀釋液配至10μg/ml，再與雜交緩沖液以1∶5的比例混勻成雜交液；

   9) 滴加預雜交液，42℃孵育2小時；

   10) 傾去預雜交液，滴加雜交液，加蓋玻片，42℃孵育16小時。
4. 雜交信號的檢測
   1) 將玻片移到預熱到37℃的甲酰胺溶液中搖動浸洗5分鐘，至蓋玻片脫落；

   2) 用2×SSC在37℃水浴中振動清洗兩次(15分鐘及30分鐘)；

   3) 用0.2×SSC在47℃水浴中振動清洗兩次(15分鐘及30分鐘)1×馬來酸緩沖液洗10分鐘，室溫；

   4) 滴加阻斷劑，30分鐘，室溫；

   5) 滴加新鮮配制的1∶1000抗地高辛堿性磷酸酶，37℃中孵育3小時；

   6) 馬來酸緩沖液洗后滴加檢測緩沖液；

   7) 滴加1∶50的NBT/BCIP，25℃避光顯色13小時，自來水沖洗；2％甲基綠復染；

   8) 切片干燥，二甲苯透明，加拿大膠封片。

5. 對照實驗
為了驗證原位雜交實驗操作的準確性以及結果的特異性，需要設置包括探針、雜交反應和檢測系統對照在內的一系列陽性對照和陰性對照。
   1) 探針對照：包括用大鼠皮膚標本進行原位雜交和用等長正意義鏈探針做原位雜交。

   2) 雜交反應對照：包括省去標記探針雜交、用未標記探針雜交及用RNA酶處理標本后雜交。
   3) 檢測系統對照：檢測時省去滴加Anti-Dig-AP步驟。