與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明的時間分辨熒光納米微球具有熒光強度高、空間位阻效應低、穩定性好等特點，基于該微球開發的時間分辨熒光免疫層析技術，具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、精密度高、樣本適用范圍光等優點，可實現待測物質的超敏、快速、定量檢測和分析。具體實施方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。
文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1一種可提高穩定性和熒光強度、降低空間位阻效應的高靈敏度時間分辨熒光微球的制備方法，包括以下步驟：(1)高穩定性聚苯乙烯納米微球的制備取50mm苯乙烯單體和2.5mm丙烯酸單體溶解于50ml含1.5mm十二烷基磺酸鈉和8mm葡聚糖(Mw：25000)的去離子水中，加入圓底燒瓶中，用磁力攪拌子攪拌均勻，然后用高純氮氣將圓底燒瓶中空氣除盡，密封加熱至75℃，加入3ml0.18mm的過硫酸鉀，密封隔氧攪拌反應12h后，降至室溫，然后將反應液用whatman2v濾紙(孔徑8μm)過濾，過SephadexG-200分子篩柱，收集最先洗脫下來的組分并濃縮至100mg/mL的濃度，加入0.05％的迭氮鈉4℃保存。通過透射電鏡測定，所制備的羧基化聚苯乙烯納米微球的直徑為210±5nm，表面電荷SurfaceCharge(μeq/g)為189.58，羧基密度ParkingArea為(sq.A/grp)為22.8，為高羧基密度微球。此步驟，通過調節加入十二烷基磺酸鈉的濃度，可獲得不同大小粒徑的聚苯乙烯微球；通過調節加入丙烯酸的濃度，可獲得不同表面羧基密度的聚苯乙烯微球。(2)不同離子摻雜銪離子螯合物的制備用甲醇分別配制10ml濃度為0.1M的三氯化銪、三氯化鐿、三氯化镥、β-二酮(β-NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)溶液，混勻密封保存。取1.5ml三氯化銪溶液(0.1M)、0.15ml三氯化鐿溶液(0.1M)、0.05ml三氯化镥溶液(0.1M)混合均勻，再加入5mlβ-二酮(β-NTA)和5ml三辛基氧化膦(TOPO)溶液，強力混勻并靜置螯合過夜。(3)高熒光強度納米微球的制備取1ml步驟(1)中制備的210nm的高穩定性聚苯乙烯微球，加入10ml去離子水和丙酮混合液中(v/v＝1:1)，37℃勻速攪拌溶脹12h，然后加入0.8ml步驟(2)制備的不同離子摻雜銪離子螯合物，37℃恒溫攪拌反應24h，最后通過減壓蒸餾方式將溶液中的有機溶劑去除，過SephadexG-200分子篩柱，收集最先洗脫下來的組分并濃縮至10mg/mL的濃度，加入0.05％的迭氮鈉4℃保存。(4)熒光微球表面的去空間位阻效應修飾取1ml步驟(3)中制備的熒光微球，溶于4ml0.05MpH6.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶液中，100w超聲處理1min，然后緩慢加入100ul15mg/mL的碳二亞胺(EDC)和200ulN-羥基珀酰亞胺(NHS)，室溫勻速攪拌活化15min后，15000RPM離心10分鐘，收集沉淀，用0.05MpH8.0的硼酸緩沖液反復洗滌離心2次。將活化的熒光微球復溶于5ml0.01MpH8.0的硼酸緩沖液中，加入20ul0.1M分子量為5000的NH2-PEG(1000)-COOH溶液，室溫勻速攪拌30min，15000RPM離心10分鐘清洗2次，最后用5ml0.05MpH6.0的硼酸緩沖液復溶，加入0.05％的迭氮鈉4℃避光保存。實施例2不同濃度和不同分子量的葡聚糖對微球穩定性的影響參照實施例1，其他條件和參數均不做調整，僅改變步驟(1)中葡聚糖的加入的量及分子量，然后將最終制備的熒光微球用30％的甲醇稀釋至1mg/ml，靜置過夜。20000RPM離心30min，取100ul上清溶液加入微孔中，然后采用PerlinElmerLifeSciences公司生產的AutoDELFIA-1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀進行測試，如上清中熒光強度越強，則說明微球中的熒光物質泄漏越嚴重，表明微球的穩定性越差，反之則說明熒光微球的穩定性越強，抗基質的干擾能力也越強。表1不同濃度和不同分子量的葡聚糖對微球穩定性的影響由表1可以看出，相比不加葡聚糖的方案，加入葡聚糖后，熒光泄露的程度均有不同程度的下降，說明葡聚糖的網狀結構可以提升微球的穩定性，且最佳的方案為葡聚糖分子量為25000，加入的濃度為8mm，在極端條件下熒光物質的泄露率可降低至不加葡聚糖的12.3％。實施例3不同離子種類及其濃度的摻雜對熒光強度的影響參照實施例1，其他條件和參數均不做調整，僅改變步驟(2)中三氯化鐿和三氯化镥加入的量，然后將最終制備的熒光微球。用純水稀釋至1mg/ml，取100ul加入微孔板中，然后用PerlinElmerLifeSciences公司生產的AutoDELFIA-1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀進行測試，如熒光強度越強，則說明螯合物的熒光增強效果越好，檢測靈敏度也會隨之增強；反之則說明螯合物的熒光增強效果越差，檢測靈敏度也會降低。表2不同離子種類及其濃度的摻雜對熒光強度的影響離子摻雜種類及比例熒光微球熒光強度Eu3+：β-NTA：TOPO＝5：50：5090000Eu3+：β-NTA：TOPO＝10：50：50150000Eu3+：β-NTA：TOPO＝15：50：50180000Eu3+：β-NTA：TOPO＝20：50：50160000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：0.5：50：50200000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：50：50220000Eu3+：Yb3+：β-NTA：TOPO＝15：3.0：50：50220000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.1：50：50280000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.5：50：50350000Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：1.0：50：50320000國外進口商品化時間分辨熒光微球1120000國外進口商品化時間分辨熒光微球2150000從表2可以看出，通過同時摻雜鐿離子和镥離子，可以大幅提高熒光微球的熒光強度，最佳的比例為Eu3+：Yb3+：Lu3+：β-NTA：TOPO＝15：1.5：0.5：50：50，通過此方案開發的微球熒光強度遠高于進口的同類產品。
上述國外進口商品化時間分辨熒光微球1為美國BangsLaboratoriesinc公司的產品，貨號為：FCEU002，粒徑為：190-210nm；上述國外進口商品化時間分辨熒光微球2為美國ThermoFisher公司的產品，貨號為：93470520010150，粒徑為：200nm；實施例4不同分子量NH2-PEG(N)-COOH修飾微球表面對空間位阻效應的影響參照實施例1，其他條件和參數均不做調整，僅改變步驟(4)中NH2-PEG(N)-COOH的分子量，然后將最終制備的熒光微球，參照CN201510089616.5“一種能同時檢測藻毒素MC-LR/RR/YR的熒光定量試紙條及其制備方法和應用”中所述的方法，標記黃曲霉毒素B1單克隆抗體，制備黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條，并測定其檢測靈敏度。如靈敏度越高，則說明熒光微球的空間位阻效應越低，反之則說明熒光微球的空間位阻效應越高。
表3不同分子量NH2-PEG(N)-COOH修飾微球表面對空間位阻效應的影響NH2-PEG(N)-COOH分子量靈敏度不修飾NH2-PEG(N)-COOH0.284μg/kg4000.258μg/kg8000.231μg/kg20000.087μg/kg50000.025μg/kg100000.036μg/kg200000.239μg/kg從表3可以看出，通過修飾分子量在800以下的NH2-PEG(N)-COOH，對提高檢測靈敏度幾乎無幫助，分子量在2000-10000范圍內時，靈敏度有比較大的提升，且最佳的分子量為5000，靈敏度較未修飾NH2-PEG(N)-COOH可提升約10倍。當分子量超過10000時，靈敏度反而有下降的趨勢。實施例5不同熒光微球標記的黃曲霉毒素B1熒光免疫層析試紙條技術性能的對比參照CN201510089616.5“一種能同時檢測藻毒素MC-LR/RR/YR的熒光定量試紙條及其制備方法和應用”中所述的方法，其他條件均不變，僅改變黃曲霉毒素B1單克隆抗體標記所使用的微球，制備黃曲霉毒素B1熒光免疫層析定量檢測試紙條，并測定其重要技術性能參數，結果如下：表4不同微球標記對產品最終性能的影響從表4中可以看出，采用本方案所制備的微球，其產品各項指標的性能均遠優于進口同類產品，可大幅提高檢測產品的靈敏度，提升產品的穩定性，降到不同基質的結果的干擾。上述國外進口商品化時間分辨熒光微球1為美國BangsLaboratoriesinc公司的產品，貨號為：FCEU002，粒徑為：190-210nm；上述國外進口商品化時間分辨熒光微球2為美國ThermoFisher公司的產品，貨號為：93470520010150，粒徑為：200nm；本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。