根據臨床表現特征的診斷甚為不易，下述線索可資提示:①HDV流行區內HBsAg攜帶者發生的肝炎。②急性乙型肝炎出現雙峰性血清ALT和膽紅素濃度波動。③病情已趨穩定的非活動性病例突然出現肝炎活動，或慢性乙型肝炎病程中表現進行性惡化。④HBV復制指標本已降低或消失而臨床表現反見惡化的病例。但是，確診則決定于HDV血清學標志的檢測。
血清學診斷：HDV抗原、抗體可同時存在于血清。篩檢中，常以抗-HD檢測為第一步驟。抗-HD檢測有放射免疫法(RIA)和酶吸附法(EIA)。
抗-HDIgM在臨床發病的急性早期便可出現，持續3~9周，于恢復期消失；倘若轉為持續感染狀態，則可持續陽性，且以7S型為主，而在病情反復活動時可有19S型出現。因此，可作為同時感染和重疊感染急性發病的鑒別。
急性發病時，在抗-HDIgM滴度開始下降之后，抗-HDIgG滴度顯示上升，但亦有限，并于2~18個月內消失。持續高滴度抗-HDIgG的存在是慢性持續性HDV感染的主要血清學標志。
采用cRNA探針斑點雜交法或逆轉錄-多聚酶鏈反應檢測HDVRNA為確定HDV感染的最敏感和直接的證據。
病程早期即HDAg血癥階段用EIA法或RIA法可檢測血清HDAg而有助于早期診斷。在慢性感染時，因血中持續存在高水平的抗-HD，HDAg多以免疫復合物的形式存在，須用免疫印跡法分離HDAg，可檢測到HDAg-P24和HDAg-P27蛋白。
組織學診斷:肝活檢標本肝細胞核內HDV(HDAg或HDVRNA)組織染色為確診手段。HbsAg陽性肝組織中HDAg檢出率達9.6%，其感染率自當更高。酶抗體法(過氧化酶)或熒光抗體法均具特異性診斷價值，但陰性病例的血清申未必都查不出抗-HD。