三代測序技術和原理介紹（二）

• Solid技術

  
  

??Solid測序技術是ABI公司于2007年開始投入用于商業測序應用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4。它的原理是：?

??圖6-a. Solid測序技術

??（1）DNA文庫構建

??片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構建單鏈DNA文庫。

??（2）Emulsion PCR

??Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統來說則要小得多，只有1um。在擴增的同時對擴增產物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區域（圖6-a）。Solid系統最大的優點就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統中輕松實現更高的通量。

??（3）連接酶測序

??這一步是Solid測序的獨特之處。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應中，這些探針按照堿基互補規則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關系。在記錄下熒光信號后，通過化學方法在第5和第6位堿基之間進行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進行下一個位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進行第二輪測序。引物n-1與引物n的區別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a. 8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位……第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。該技術的讀長在2×50bp，后續序列拼接同樣比較復雜。由于雙次檢測，這一技術的原始測序準確性高達99.94%，而15x覆蓋率時的準確性更是達到了99.999%，應該說是目前第二代測序技術中準確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發生錯誤就容易產生連鎖的解碼錯誤。

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??圖6-b. Solid測序技術

??第三代測序技術

??測序技術在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。

??其中PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思想5，并以SMRT芯片為測序載體。基本原理是： DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區別出來。他們利用的是ZMW（零模波導孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態（光衍射的原理）,從而可起保護作用。同理,在一個反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區,能量被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應區域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息（圖7）。SMRT技術的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術的通病），達到15%,但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯。

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圖7.PacBio SMRT測序原理

??Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米單分子測序技術與以往的測序技術皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術5。該技術的關鍵之一是，他們設計了一種特殊的納米孔，孔內共價結合有分子接頭。當DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。

??該公司在去年基因組生物學技術進展年會(AGBT)上推出第一款商業化的納米孔測序儀，引起了科學界的極大關注。納米孔測序（和其他第三代測序技術）有望解決目前測序平臺的不足，納米孔測序的主要特點是：讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb;錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機錯誤，而不是聚集在讀取的兩端;數據可實時讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內完成);起始DNA在測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜。理論上，它也能直接測序RNA。

??納米孔單分子測序計算還有另一大特點，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像傳統方法那樣對基因組進行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關現象有極大的幫助。并且改方法的測序準確性可達99.8%，而且一旦發現測序錯誤也能較容易地進行糾正。但目前似乎還沒有應用該技術的相關報道。??

??圖8. 納米孔測序

??其他測序技術

??目前還有一種基于半導體芯片的新一代革命性測序技術——Ion Torrent6。該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片， 一個小孔就是一個測序反應池。當DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子，反應池中的PH發生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉化為數字信號，從而讀出DNA序列（圖9）。這一技術的發明人同時也是454測序技術的發明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。Ion Torrent相比于其他測序技術來說，不需要昂貴的物理成像等設備，因此，成本相對來說會低，體積也會比較小，同時操作也要更為簡單，速度也相當快速，除了2天文庫制作時間，整個上機測序可在2-3.5小時內完成，不過整個芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。

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??????圖9. Ion Torrent

??小結

??以上，對各代測序技術的原理做了簡要的闡述，這三代測序技術的特點比較匯總在以下表1和表2中。其中測序成本，讀長和通量是評估該測序技術先進與否的三個重要指標。第一代和第二代測序技術除了通量和成本上的差異之外，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想。第二代測序技術的優點是成本較之一代大大下降，通量大大提升，但缺點是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率，并且具有系統偏向性，同時讀長也比較短。第三代測序技術是為了解決第二代所存在的缺點而開發的，它的根本特點是單分子測序，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導至的系統錯誤，同時提高讀長，并要保持二代技術的高通量，低成本的優點。

??表1：測序技術的比較??

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??表2：主流測序機器的成本測序比較

??以下圖10展示了當前全球測序儀的分布情況。圖中的幾個熱點區主要分布在中國的深圳（主要是華大），南歐，西歐和美國。