改進的人類腸道微生物組的高分子量DNA提取，納米孔測序和宏基因組學裝配

Improved high-molecular-weight DNA extraction,
nanopore sequencing and metagenomic
assembly from the human gut microbiome

Nature Protocols [IF: 10.419]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41596-020-00424-x

發表日期：2020-12-04

第一作者：Dylan G. Maghini¹

通訊作者：Ami S. Bhatt
(asbhatt@stanford.edu)^1,2

合作作者：Eli L. Moss,Summer E. Vance

主要單位：

¹美國斯坦福大學遺傳學系(Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA, USA)

¹美國斯坦福大學醫學系(Divisions of Hematology and Blood & Marrow Transplantation, Department of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA)

寫在前面

分享標題：Nature 子刊：三代測序的DNA提取和宏基因組學分析

關鍵字：宏基因組學，生物信息學，文庫制備，長讀長測序，人類腸道菌群，高分子量DNA

摘要

人類腸道菌群的短讀長宏基因組測序和從頭基因組組裝無需分離和培養即可獲得細菌基因組草圖。然而，由短讀長測序組裝的細菌基因組通常是片段化的。此外，這些由宏基因組組裝的基因組通常不包括重復的基因組元件，例如移動遺傳元件，從而損害了我們對這些元件對重要細菌表型貢獻的理解。雖然長讀長測序已成功應用于連續細菌分離基因組的裝配，但從糞便樣本中提取足夠分子量、純度和數量以進行宏基因組測序的DNA可能具有挑戰性。在此，我們提出了一種從人類糞便樣本中提取微克量的高分子量DNA的方法，該方法適用于下游長讀長測序的應用。我們還介紹了Lathe (www.github.com/bhattlab/lathe)，這是一種用于長讀長堿基識別、組裝、長讀長和Illumina短讀長的校對和基因組環化的計算工作流程。總而言之，此方法可以在大約10天內，包括2天的實驗操作和計算下從復雜的人類腸道樣本中產生高質量的連續或環狀細菌基因組。

步驟概述

在這里，我們描述了從人糞便樣品中提取高分子量(HMW)DNA的改進方案(圖1)，以及對測序方法的建議以及用于長讀長數據的宏基因組組裝/拼接的工作流程(圖2)。具體來說，我們描述了用于酶促細菌細胞裂解(步驟2-4)，RNA和蛋白質消化(步驟7)，樣品純化(步驟8和9)和DNA片段選擇(步驟13-15)的方法以及我們針對長讀長組裝軟件、拋光方法和錯誤校正的建議。濃縮DNA的提取方法見補充說明1。

圖 1 高分子量DNA提取工作流程

High-molecular-weight DNA extraction workflow

翻譯如下圖

最好使用帶柱塞的活檢打孔器將冰凍的糞便等分，并特別注意刀刃。將糞便分成等份試樣后，DNA提取工作流程將繼續進行樣品懸浮，酶解和化學裂解以及DNA純化。Qiagen Genomic-tip是一種基于色譜柱的純化方法，旨在最小化DNA的剪切。使所有試劑在重力作用下流過基因組尖端色譜柱；請勿使用注射器或真空泵抽液，因為這會損壞色譜柱。提取DNA后，選擇大片段以使用在定制緩沖液中制備的SPRI珠子。應分別使用Qubit熒光計，NanoDrop分光光度計和Agilent TapeStation評估提取的DNA的濃度，污染情況和大小分布。DNA被提取并達到質量閾值后，可以通過文庫制備方法進行納米孔測序。EtOH-乙醇。

圖 2 測序后生物信息學分析工作流程

Post-sequencing bioinformatic workflow

翻譯如下圖

測序完成后，在使用Flye或Canu組裝軟件進行組裝之前，使用計算組裝工作流程(步驟25)對原始納米孔信號進行堿基識別。然后，工作流程提供了可選的修飾步驟，方法是將短或長讀長與組裝片段比對，并用比對讀長的共有堿基(橙色)校正單個核苷酸錯誤和插入缺失(綠色)。最后，工作流用于通過自我對齊和修剪或末端重疊群的裝配來執行環化步驟。