三十五項淘汰臨床檢驗項目、方法及替代實驗(20)

二、血清高密度脂蛋白膽固醇測定

　　HDL是血清中顆粒數最多的脂蛋白，一般可分為HDL2及HDL3兩部分。流行病學及臨床研究證明，HDL-C減少(主要是HDL2—C減少)是冠心病的危險因素后，測定HDL-C的需求不斷增加。因為HDL中含蛋白質與脂質各半，脂質中主要為磷脂與膽固醇，通常以測定膽固醇含量(HDL-C)代表HDL水平。我國人HDL-C占血清TC的28％一30％。測定的第一步是將HDL與其他脂蛋白分離。現在臨床檢驗中大都用大分子多陰離子化合物與兩價陽離子沉淀LDL與VLDL，然后用酶法測定上清液中的膽固醇。早期用肝素—Mn₂₊為沉淀劑，有時VLDL沉淀不完全。后來美國脂質研究中心(Lipds ResearchCenter，LRC)推薦硫酸葡聚糖(DS)—Mn₂₊法，所用DS分子量50000，法國Sochibo產品，昂貴而不易購得。現今國內外試劑盒大都用磷鎢酸(PTA)—Mn2+沉淀，試劑價廉易得，使用方便，結果與肝素—Mn₂₊法和DS—Mn₂₊法基本一致。以下介 紹此法。

(一)原理

　　血清中含apoB的脂蛋白[包括LDL、VLDL與Lp(a)]經PTA—Mn₂₊沉淀后，上清液HDL，其膽固醇含量用酶法測定(同TC測定)。

(二)試劑??

1．沉淀劑

　　稱取PTA 0．440g與MgCl₂·6H₂0 1.10g(均用分析試劑)，溶于80ml蒸餾水中，以lmol／LNaOH液校pH至6.15(約用1.3m1)，然后以蒸餾水定容至100ml，此試劑至少穩定一年。

2．酶試劑? 同TC測定。

3．參考標準? 低膽固醇的定值血清。或將TC測定用定值血清適當稀釋(1:2或1:3)后用。

(三)測定操作

　　用早晨空腹(12小時)血，當天上午測定。如需冰凍保存，只能凍一次，化凍后即測定。

　　于小離管中加血清200μ1，沉淀劑200μ1，充分混合，室溫放置10分鐘后離心(3000轉／分鐘，15分鐘)，吸取上清液測膽固醇，按表1操作。

　　表1? 血清高密度脂蛋白膽固醇酶法測定的操作

　　混勻，敢置37℃、5分鐘(時間可隨試劑盒而定)后，用光度計500nm測吸光度(A)

　　計算： 　　　　　　　　　　標本管A
　　　　　　HDL-C(mmol／L)＝--------------X定值血清膽固醇(mmol／L)
　　　　　　　　　　　　　　　　標本管B

(四)參考值

　　成年男性1.16—1.42mmol／L(45—55mg／d1)，女性1.29—1.55mmol／L(50—60mg／d)，隨年齡的變動很小。通常以0.9mmol／L(35mg／皿)以下為明顯偏低。

(五)附注：

1．血清在室溫下放置時，各類脂蛋白之間還會進行脂質交換，游離膽固醇不斷酯化，故須及時測定，否則應低溫保存。

2．沉淀后的上清液必須澄清，在血清嚴重渾濁時LDL與VLDL不易沉淀完全，此時可用生理鹽水將血清作1：1稀釋后再行沉淀，測得結果乘以2。

3．血清加沉淀劑后必須在4小時內完成膽固醇測定

4．美國CDC制備的HDL-C參考血清需要與標本同時進行沉淀及膽固醇測定兩個步驟，在一60℃保存可穩定6個月，每小管化凍后只供一次使用。CDC對HDL-C測定的準確性有較高要求，血清HDL—C水平<40mg／d1、40—59．9mg／dl及>60mg／d1時，重復測定的最大可允許偏差分別定為2.5，3.0及3.5mg／d1。國內HDL-C測定方法不統一，尚無合適的參考物及質控血清供應，各地報道的參考值差異較大。

三、血清低密度脂蛋白膽固醇測定

　　前面已述及LDL-C的Friedewald公式計算法，現在簡單介紹直接測定法，即選擇性沉淀LDL的方法，這類方法有幾種，例如有的試劑盒應用肝素—枸椽酸鈉沉淀法，其缺點是要嚴格控制反應pH。所以現在用聚乙烯硫酸(PVS)沉淀法者較多，如Boehringer試劑盒為美國LRC所選用。

(一)原理

　　用PVS選擇性沉淀血清中的LDL，測出上清液中的膽固醇代表HDL－C與VLDL-C之和，所以TC減去上清液膽固醇即得LDL-C值。試劑中含EDTA用以去除兩價陽離子，避免VLDL共同沉淀。適量的中性多聚物(聚乙二醇獨甲醚，PEGME)用以加速沉淀。膽固醇測定同TC測定。

(二)試劑?

1．沉淀劑

　　每l00ml中含PVS鉀鹽30mg，EDTA·Na₂—2H₂0186mg及PEGME 16ml。可在4℃冰箱存放，至少穩定3個月。(PEGME為粘稠性液體，要確保加量準確。)

2．酶試劑　　同TC測定。

3．參考標準　　同TC測定用定值血清。

(三)操作步驟

　　用早晨空腹血清。如在4℃存放不得超過4天，深低溫保存只能凍一次，化凍后即須測定。於小離心管中加入血清200μl，沉淀劑100μl，混合，室溫放置15分鐘，離心(3000轉／分鐘，15分鐘)，取上清液按表2操作．

　　表2? 血清低密度脂蛋酶法測定的操作手續

　　混合后，放置37℃，5分鐘，用光度計測吸光度(A)，波長500nm。

計算：　　　　　　　　　　　　　　標本管A
　　　上清液膽固醇 (mmol／L)＝---------------X定值血清膽固醇(mmol／L)
　　　　　　　　　　　　　　　　　標本管B

　　　LDL-C(mmol／L)＝TC一上清液膽固醇(mmol／L)

(四)參考值

　　LDL-C水平隨年齡上升，中、老年人平均約2.7—3.lmmol／L(105—120mg／dL)。一般以3．36mmol／L(130mg／d1)以下為合適水平：4.14mmol(160mg／d1)以上為危險水平；3.36—4.14mmol之間為危險邊緣或程度危險(危險是指動脈粥樣硬化發生的潛在危險性)。

(五)、附注

1．本法沉淀物中也包括Lp(a)，因Lp(a)膽固醇較低，通常對LDL-C測出結果不作校正。

2．VLDL很高時影響LDL沉淀。血清甘油三酯在4.5mmol／L(400mg／d1)以下時，與超離心結合沉淀法(美國LRC法)結果一致。甘油三酯4.5mmol／L以上時，多數標本測定結果仍與LRC法一致，部分標本會因LDL沉淀不完全而使結果偏低。故在血清嚴重混濁時，可將血清稀釋一倍后測定。

3．干擾因素除高VLDL外，顯色反應的干擾物同TC測定。

4．血清與沉淀劑混合后，放置時間不得超過一小時。

5．本法精密度好，批內與批間CV<2％。