三氯乙酸沉淀實驗

2. 作為蛋白質變性劑使蛋白質構象發生改變，暴露出較多的疏水性基團， 使之聚集沉淀。

3. 隨著蛋白質分子量的增大，其結構復雜性與致密性越大，TCA 可能滲入分子內部而使之較難被完全除去，在電泳前樣品加熱處理時可能使蛋白質結構發生酸水解而形成碎片，而且隨時間的延長這一作用愈加明顯。

蛋白樣品

丙酮分子量標準TCA+DOC加與不加2-巰基乙醇的樣品緩沖液

聚丙烯微量離心管

材料與設備

丙酮（Aldrich Chemical Co.Inc.)
注：保存于室溫。不能放入冰箱。

聚丙烯微量離心管 (1.5-ml)
注：1. 用前將離心管洗干凈。2. 分析極少量蛋白質（<100ng)時，也許必需按下述方法將離心管硅烷化：將離心管短時（5 min)浸泡于5%(v/v)二氯二甲基硅烷（Aldrich Chemkai Co.Inc.）氯乙烯溶液中，然后用乙醇（100%)和玻璃蒸餾水洗滌。離心管在室溫下至少干燥1天, 硅烷化后，有些蛋白質與聚丙烯結合較緊。不幸的是這一性質相對而言是經驗性的，不能預先知道待測蛋白質是否會留存于洗凈的聚丙烯或硅烷化的離心管壁上。

分子量標準（任選)

試劑與緩沖液

TCA+DOC

加與不加2-巰基乙醇的樣品緩沖液（1X)

(配方，見"試劑與緩沖液的配制，P.262)

操作程序

1)加1/4體積的 TCA+DOC于蛋白質組分（置1.5-ml聚丙烯微量離心管中），至TCA的終濃度為20%(w/v)。震蕩混合。

2)冰上解育20~30 min。

3)微型離心機，室溫離心15 min。沉淀物如可見，為粘稠的帶黃褐色的膠狀物。用一精細的巴氏吸管吸出上清。努力除去盡可能多的上清。如取100ul樣品進行沉淀，沉淀物將是可見的。

4)加3倍體積（原樣品體積的丙酮（室溫)。樣品在室溫下靜置約10 min, 使TCA+DOC溶于丙酮。

5)室溫離心15 min。其時，沉淀物的大小和物理特性類似于一點灰塵。約10ug或更多一點的蛋白質即可看見。有時，會得到白色的鹽類（如KCl等）沉淀物。用極精細的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞開1.5-ml離心管的蓋)。干燥的沉淀物可長時間（>1 個月）地保存于-20℃。

6) 用含 2-巰基乙醇的樣品緩沖液（lx)(對于標準的小型平板凝膠裝置，用 6ul) 溶解沉淀物。如仍有少量的TCA 殘留物，溴酚藍將轉呈黃色。這無關緊要，因為電泳時有足夠的緩沖能力來中和痕量 TCA。如沉淀物中有殘留的 KCl, 將樣品緩沖液加于沉淀的蛋白質時，將會形成絮狀的白色沉淀（十二烷基硫酸鉀）。如十二烷基硫酸鉀發生沉淀，就很難將樣品加于 SDS 凝膠，但樣品一旦加到凝膠上，電泳將會很好地進行。

7) 若需分子量標準參照物，則可用不含 2-巰基乙醇的 lxSDS 樣品緩沖液將蛋白質分子量（MW) 標準配制成每毫升含 0.5 mg 總蛋白的儲液。分成小等分試樣 (50ul) 儲存于-20℃。對于銀染，可取 2ul 分子量標準+4ul 含 2-巰基乙醇的樣品緩沖液，至終體積為6ul。

1. 蛋白沉淀實驗中，要充分震蕩使得三氯乙酸能夠與溶液中的蛋白質充分結合

2. 室溫下孵育10min

三氯乙酸是最有效的蛋白沉淀劑，但試劑中常常含有雜質，致使影響方法中的空白值偏高，其次是出去蛋白質后若采用乙醚為提取溶劑，則三氯乙酸會溶于乙醚中干擾測定。

本實驗介紹關于三氯乙酸沉淀法的過程。本實驗來源于蛋白質純化與鑒定實驗指南，作者：朱厚礎。