有典型有機酸尿癥癥狀，尤其是表現為顯著低血糖或Reye綜合征者應考慮本病。尿中排泄大量3-羥基異戊酸和3-甲基巴豆酰甘氨酸可診斷。這些有機酸的增高不應伴有多種羧化酶缺乏時出現的異戊酰甘氨酸、3-甲基戊烯二酸、3-羥-3-甲基戊二酸、3-羥基丙酸、甲基枸櫞酸和乳酸等。伴有酮癥的病例可排出中等量的3-羥基丁酸和乙酰乙酸，可能有繼發性二羧酸尿。任何原因引起的嚴重酮癥均可導致3-羥基異戊酸中度增高（50～200mmol/mole肌酐，正常為l～20mmol/mole肌酐），但通常低于本癥所見，且酮癥不會產生繼發性3-甲基巴豆酰甘氨酸增高。最終確診單純性三甲基巴豆酰輔酶A羧化酵素缺乏癥，并排除多種羧化酶缺乏，應檢測到病人白細胞中此酶活性降低，并與生物素治療無關；或在不同生物素濃度培養條件下成纖維細胞中該酶活性降低，且其他羧化酶活性應正常。因雜合子酶活性通常在正常范圍內，故不能靠白細胞或培養成纖維細胞中酶活性測定檢出。通過穩定同位素稀釋法測定羊水中增高的3-羥基異戊酸濃度，以及測定絨膜絨毛標本或培養羊水細胞中3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶活性可進行產前診斷。