三聚氰胺的樣品制備及檢測

三聚氰胺是一種重要的化工材料，本來與食品、飼料行業毫不相干，但是發生在美國的數起飼料致死寵物的事件使兩者聯系在一起。經過調查，發現這些進口飼料中含有一定濃度的三聚氰胺，對此，美國食品藥品監督管理局（FDA）要求飼料廠商提供三聚氰胺的檢測報告，因此，三聚氰胺事件也使得分析領域掀起了檢測方法的開發熱潮。

三聚氰胺事件變成社會熱點話題是在2007年3月份，美國大量召回被三聚氰胺污染的寵物飼料，起因于寵物飼料致死貓狗的事件。據不完全統計，北美地區僅美國因食用有毒飼料而死亡的寵物就有上萬只, 相關投訴不計其數，美國食品藥品管理局調查顯示，在回收的寵物食品、 死亡動物的尿液結晶和腎臟細胞中都發現有三聚氰胺，研究人員還發現, 回收寵物食品所用的小麥谷蛋白添加物中有較高濃度的三聚氰胺存在。盡管國內尚無動物中毒死亡或產生不良反應的報道，對于三聚氰胺的毒性也有些爭議，但三聚氰胺不是飼料原料，也不是國家允許使用的飼料添加物。某些不法廠商添加三聚氰胺主要是為了增加產品的表觀蛋白質含量，三聚氰胺被廣泛添加到淀粉、谷朊粉、蛋白粉中，致使不僅是飼料生產商，其它的食品工廠也需要三聚氰胺的檢測以保證他們產品的安全。

三聚氰胺理化性質

三聚氰胺（melamine）簡稱三胺，學名三氨三嗪, 別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、C3N3（NH2）3，分子量：126.12，是一種重要的氮雜環有機化工原料。物理性能：白色結晶粉末，無毒，無味，相對密度：1570kg/m3，熔點 ：在常壓下，354℃分解，升華溫度：300℃。溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳。水溶液呈弱堿性。化學性能：三聚氰胺顯弱堿性，能夠與各種酸反應生成三聚氰胺鹽。在強酸或強堿液中，三聚氰胺發生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應生成加成化合物。三聚氰胺與醛反應制成樹脂，三聚氰胺樹脂是一種多種用途的材料，防火耐熱且有很高的穩定性，用于生產塑料、廚房用具、防火纖維、商業濾膜、膠水和阻燃劑，在部分亞洲國家，也被用來制造化肥。

樣品前處理方法

固相萃取（SPE）柱的選擇

三聚氰胺呈弱堿性（弱陽離子化合物），凈化過程一般應選擇陽離子交換柱。混合型的陽離子交換柱（PCX）通過將磺酸基團（-SO3H）鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機理，并具有以下優點：

可通過兩種不同溶液的洗滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機溶劑），使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度；

批次重復性好；

回收率高，重現性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。

綜上考慮，檢測中選擇混合型的陽離子交換柱（Agela ClearnertTM PCX）來凈化樣品。

樣品前處理步驟

標準樣品配制

取50mg三聚氰胺標準品，以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的標準溶液，使用時，以提取液（0.1%三氯乙酸）稀釋至所要的濃度。

提取

稱取飼料樣品5g，加入50ml 0.1%三氯乙酸提取液，充分混勻，加入2ml 2%乙酸鉛溶液，超聲20min。然后取部分溶液轉移至10ml離心管中，8000rpm/min離心10min，取上清液3ml過混合型陽離子交換小柱（PCX）。

凈化（PCX小柱，60mg/3ml）

活化及平衡：3ml甲醇，3ml水；上樣：加入提取液3ml；淋洗：3ml水，3ml 甲醇，棄去淋洗液并將小柱抽干；洗脫：5ml 5%氨化甲醇（v/v）洗脫。（5%氨化甲醇的配制：5ml氨水+95ml甲醇）；濃縮：50℃，氮氣吹干，20%甲醇/水定容至2ml，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

HPLC檢測方法

三聚氰胺HPLC-UV檢測方法

三聚氰胺是強極性化合物，在傳統的反相C18柱上保留很差，需要用離子對試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國食品藥品監督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測方法和中國農業部公布的三聚氰胺檢測方法，采用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱，可以得到良好的分離效果，分析色譜圖見圖1。

由表1可以看出：用PCX柱凈化樣品，可以得到滿意的回收率，此方法處理樣品，比FDA公布的前處理方法更加準確、可靠。

三聚氰胺LC-MS檢測方法

由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動相添加了離子對試劑，因此限制了液質聯用方法的使用；但不用離子對試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統的C18柱上保留很差，不能得到較好的分離定量。

基于此問題，艾杰爾科技公司自主開發了新的方法，采用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱，不用離子對試劑也能得到有效的保留與分離。因此方法中流動相不含離子對試劑，可以用于質譜檢測。

與FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation （HPLC-UV）》相比較，該方法大大降低了最低檢測限（MSD 0.5ppm UV 2ppm），提高了檢測靈敏度。以該方法得到的譜圖見圖2。

LC-MS方法小結

該方法具有以下優點，檢測過程簡便：無須添加離子對試劑，三聚氰胺就可得到良好的保留與分離，避免了配制離子對流動相的復雜過程；提高了檢測的靈敏度：無離子對試劑，可以用于質譜檢測器，大大降低了最低檢測限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）；降低了檢測成本：不用離子對試劑，就不再需要買價格較貴的離子對試劑了，從而降低了檢測成本；延長了色譜柱的使用壽命：避免了使用離子對試劑減少色譜柱壽命的影響；該方法所使用的色譜柱具有通用性：無論是用FDA方法、中國農業部部頒標準方法和本公司開發的LC-MS方法，使用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱均能得到一個很好的檢測結果，從而給客戶提供了多種選擇空間。