上轉發光技術在食品病原微生物檢測中的應用

近年來，由食源性致病微生物引發的疫情不斷發生，食品安全已成為世界各國共同面臨和關注的問題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一。快速而準確地檢測出被稱為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務，因此建立一種快速、準確、便捷的檢測技術，對于從源頭制止食源性致病菌污染，預防疫情的發生具有重要意義。傳統的食源性致病菌檢測方法主要有微生物培養法、電阻電導測定法、細菌直接計數法、分子生物學法、免疫學方法等。但傳統微生物檢驗方法，不僅步驟復雜，而且耗時費力、靈敏度也不高，難以滿足當前的任務需求。

上轉發光技術

上轉發光技術(up-converting phosphor technology，UPT)是基于上轉發光材料(up-converting phosphor，UCP)而發展起來的一種新型標記技術，UCP是由幾種稀土金屬元素摻雜于某些晶體的晶格中構成的納米級顆粒。由于獨特的結構，UCP可由紅外光激發而發射可見光——上轉發光(up-converting)。這種絕無僅有的性質使UCP作為標記物在生物分析中，以無本底干擾、無焠滅、適于多重分析和定量分析等具有顯著優勢，從本質上有別于傳統標記物。因此一種叫做上轉換發光顆粒免疫層析(UPT-LF)的檢測技術應運而生，因其具有對樣品種類的耐受程度高，不受操作環境、技術人員及設備的限制，操作過程簡單快速的同時能夠得到多重定量結果等諸多優點逐漸發展起來。

上轉發光技術檢測原理

UCP包括3種主要成分：主基質、吸收子和發射子，由于其獨特的結構,可以出現反Stokes現象,即這種材料可在紅外光區(波長>780nm)被激發,卻發射波長遠短于激發光的可見光(波長為475～670nm),這一現象在自然界中并不存在,其基本原理是雙光子或多光子熒光,即能量上轉。選擇不同的吸收子、發射子和主基質可使UCP具有不同的光學性質,成為其使用靈活的基礎。

上轉發光技術與經典的免疫層析技術相結合，采用新型標記物——UCP上轉發光材料，通過掃描分析光電信號，實現對目標抗原或抗體的現場快速檢測。上轉發光技術試紙條是由UPT與免疫層析共同組成，主要由試紙條以下5個部分組成：樣品墊、結合墊又稱結合物稀釋墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。疊合順序如下圖所示，通過粘膠固定于粘性底襯上。

檢測時，首先將待檢樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用進入結合墊，使其中固定的標記物——生物活性分子結合物重新解離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開結合墊流入分析膜，向吸水墊的方向流動。此過程中標記物——生物活性分子結合物、目標被檢物與檢測帶、質控帶之間將發生一定的特異性免疫反應，并通過具有指示性的標記物產生反應信號。

上轉發光技術發展歷程

我國屬稀土資源大國，軍事醫學科學院和北京熱景生物技術有限公司早在2000年就已經完成了UCP顆粒的制備，并且取得了一定的突破; 2002年創造了以UCP為基礎的自主研制PCT；2003年，研制出了第一代UPT免疫分析儀；2005年研發了第三代（UPT-3A）便攜式系統，應用于國家安全、部隊、疾控生物戰劑檢測，在生物應急領域，研制完成的UPT檢測系統可快速檢測鼠疫菌、炭疽芽孢、布魯氏菌、抗鼠疫抗體、抗SARS-CoV抗體、霍亂O1菌、霍亂O139菌等多種病原體，已推廣至多個地方疾控系統——北京市衛生局、中國檢驗檢疫科學研究院、防化研究院、鼠疫防治系統等職能單位；2008年，UPT系統已經實現了產業化；2011年獲得國內第一個自主知識產權現場檢測技術生產文號，并獲得了完整的工藝流程與系統產品，已經開發出了面向臨床、生物反恐、食品安全快速檢測儀器及試劑，總共獲得12個產品批準文號，該系列產品打破了國外技術的壟斷，項目產品已經用于臨床檢測、軍隊和地方生物反恐、食源性致病菌檢測等；2014年該項目獲得中華醫學會二等獎、北京市科技進步二等獎；2016年9月獲得北京市高新技術成果轉化項目-生物技術領域第一名。

上轉發光技術在食品病原微生物檢測中的應用

據WHO估計，由于全球性食品貿易的快速增長以及人口的流動，飲食習慣的改變，新食源性致病菌不斷出現，全世界每年發生食源性疾病數10億人，每年約有200萬兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細菌性致病菌所致。食源性致病菌導致的疾病是食品安全的關鍵問題，其中動物源性食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。

UCP作為標記物的免疫層析技術，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無背景吸收、無焠滅等特點，賦予了免疫層析技術新的特性。傳統的橫向流方法通常用有色顆粒標記，像膠體金或著色，通過顏色識別結果，然而，定性以及較低的靈敏度限制了其檢測應用，而UCP顆粒在最低檢測線下仍然可以檢測，用基于橫向流的上轉發光技術分析，可以在10⁹CFU/mL的微生物環境下檢測到10³CFU/mL的大腸桿菌O157:H7，濃度變異系數在0～10⁷organism/mL之間均<10%，對于較小的微生物，最低檢測線在5ng/mL以下。而且，此技術可以進行多重檢測，可同時進行多靶標檢測。研究發現，使用上轉發光免疫層析試紙盒可對包括乙型副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌O1、O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、副溶血弧菌、傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌在內的10種食源性致病菌進行檢測，不增菌檢測敏感性為10⁹～10⁵CFU/mL，增菌敏感性<10CFU/mL。均可滿足食物樣本增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度需求。線性擬合系數R2介于0.9～0.98之間，均具有良好的定量能力。每種試紙與其它9種菌之間無明顯交叉反應，特異性良好。

上轉發光技術在食品病原微生物檢測中的應用前景

李斯特氏菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食品致病菌，已經成為威脅食品安全的頭號殺手，快速而準確檢測出被稱為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務。上轉發光技術的UCP顆粒因其具有對樣品種類的耐受程度高，不受操作環境、技術人員及設備的限制，操作過程簡單快速的同時能夠得到多重定量結果等諸多優點逐漸發展起來，可以廣泛應用于國內基層單位對食源性致病菌現場快速檢測及診斷。隨著對UCP研究的不斷深入，上轉發光技術在食品中病原微生物檢測的經濟價值、產業需求以及發展前景將不可限量。