不同產地鐵皮石斛多糖的提取與含量的測定

在《神農本草經》中，石斛被列為上品藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效。現代藥理研究表明，藥用石斛的有效成分主要是生物堿和多糖，具有抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用。由于石斛用藥的擴大，需要大量的石斛原材料投入藥品的生產和研制。據全國中藥資源調查統計，石斛每年需求量為80萬～100萬 kg，國內外植物藥材市場對石斛的需求量每年約以20%的速度增長，而野生資源的匱乏，今后只能依靠人工栽培來大量滿足市場需求。在國外，20世紀30年代就有日本學者對石斛鑒別進行研究，但對石斛藥理研究、栽培加工生產大多還是集中在國內。石斛產業發展急需優化種質資源。石斛屬植物品種多，由于引種栽培歷史較短，目前生產上栽培的石斛品種種質混雜，通過對石斛品種資源收集、保存和鑒別，可為促進人工栽培石斛提供優質的品種資源支持。為此，采集不同產地的石斛，進行多糖含量的測定，為藥用石斛品種資源的鑒別、篩選提供依據，具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

石斛采集于全國各產地，經廣西藥用植物園李力研究員鑒定均為正品，陰干，粉碎后備用。詳見表1。

表1 不同產地品種石斛藥材

序號產地藥材名稱1廣西西林縣鐵皮石斛2廣西桂平白石山鐵皮石斛3浙江溫州鐵皮石斛4廣西容縣都嶠山鐵皮石斛老條5廣西上林縣綠桿南山鐵皮石斛6廣西靖西縣樹上仿野生種植——南山鐵皮石斛7廣西大新縣紅桿南山鐵皮石斛

1.2 試驗儀器及試劑

紫外分光光度計UV-2550：日本SHIMADZU；石油醚（餾程60 ℃～90 ℃，AR）、濃硫酸（98%，AR）、苯酚（AR）等：西隴化工股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

參照文獻[1-3]設計，精密稱取浙江鐵楓石斛藥材粉末50.55 g，加入石油醚500 mL回流提取3次，每次2 h，過濾。藥渣揮干，加入80%乙醇500 mL回流提取3次，每次2 h，過濾。藥渣揮干，加入1 000 mL蒸餾水煎煮3次，每次1 h。過濾得到水提取液，合并濃縮至約200 mL，得水提濃縮溶液（粗多糖提取液），轉移至分液漏斗中，采用Sevag法除蛋白，加入50 mL氯仿-正丁醇混合溶液，振搖萃取，分取水層，同法操作數次，直至無乳白色沉淀出現為止。所得水層即為脫去蛋白的多糖溶液，抽濾，向50 mL濾液中加入乙醇至其濃度為80%，靜置過夜，抽濾，將所得沉淀用丙酮、乙醚、95%乙醇分別進行洗滌，沉淀自然揮干，得到多糖2.672 2 g，置于干燥器中備用。

2.2 溶液的配制

2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制

精密稱取葡萄糖對照品0.050 7 g，加蒸餾水溶解，定容于250 mL量瓶中，配成0.202 8 mg/mL葡萄糖標準溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

稱取藥材粉末2 g，精密稱定得2.001 1 g，加入石油醚50 mL回流提取3次，每次2 h，過濾。藥渣揮干，加入80%乙醇40 mL回流提取3次，每次1 h，過濾。藥渣揮干，加入60 mL蒸餾水于90 ℃保溫提取2 次，每次1 h，過濾，用熱蒸餾水反復洗藥渣并與過濾所得水提取液合并，采用Sevag法除蛋白后，定容至250 mL量瓶中，得樣品溶液。

2.2.3 測定方法

采用硫酸-苯酚顯色法測定，取多糖溶液1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冷水浴中加入5.0 mL濃硫酸，于沸水浴中加熱10 min，于冰水浴中冷卻至室溫，放置20 min，在489 nm下測定吸光度。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取8.5 mg的葡萄糖對照品，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，得到0.085 mg/mL對照品溶液，吸取1，2，4，6，8和10 mL葡萄糖對照品溶液分別置于10 mL量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取系列對照品溶液各1 mL，置于10 mL具塞試管中，均加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冷水浴中加入5.0 mL濃硫酸，于沸水浴中加熱10 min，于冰水浴中冷卻至室溫，放置20 min，在489 nm下測定吸光度，另精密吸取1 mL蒸餾水，同法操作，作為空白參比。以吸光度（A）為縱坐標，以系列對照品溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。得線性回歸方程A=10.438 9C，相關系數r=0.993 0，線性范圍0.017～0.085 mg/mL。

2.3.2 換算因子的測定

取多糖100 mg，共3份，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，搖勻，得多糖水溶液，精密吸取10 mL，置于50 mL量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用。精密吸取此液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測定吸光度，由標準曲線計算溶液中葡萄糖濃度，按式（1）求出換算因子。

式中：W——稱取多糖的質量，mg；C——葡萄糖濃度，mg/mL；D——稀釋倍數。

多糖的換算因子計算見表2。由此可得換算因子f=3.879 8，結果見表2。

表2 換算因子測定結果表

序號精制多糖2100.10.5160.0494.110 2 3101.10.5680.0543.744 4質量/mg吸光度A供試液葡萄糖濃度/mg·mL-1換算因子f換算因子平均值1100.30.5550.0533.789 4 3.879 8

2.3.3 精密度試驗

精密吸取1 mL樣品溶液（廣西桂平白石山）置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測定吸光度，重復取樣測定5次。精密度RSD計算結果為0.30%。

2.3.4 穩定性試驗

精密吸取樣品溶液（廣西桂平白石山）1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法，在0，20，40，60，80和100 min測定吸光度，考察樣品溶液在2 h內的穩定性。測定結果RSD值為1.39%。

2.3.5 重現性試驗

取石斛藥材（廣西桂平白石山）粉末2 g，共5份，精密稱定，按照2.2.2的方法制備樣品溶液，精密量取樣品溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照“2.2.3”項下方法測定吸光度，計算多糖含量及RSD值，結果多糖含量為4.05%，RSD%為3.76%，重現性良好。

2.3.6 加樣回收試驗

精密吸取5份已知多糖含量（1.13 mg/mL）的樣品溶液（廣西桂平白石山）30 mL置于50 mL量瓶中，分別加入葡萄糖對照品溶液10 mL，用蒸餾水定容，搖勻，從中精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測定吸光度，計算回收率及RSD值，結果見表3。

表3 加樣回收試驗測定結果

編號質量濃度/mg·mL-1回收率/%平均回收率%RSD/% 10.072 0103.5 20.071 9101.1 30.071 796.2 40.072 1106.0 50.072 0103.5 102.13.67

2.4 多糖含量的測定

按照2.2.2的方法制備樣品溶液，平行制備3份，各精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測定吸光度，由標準曲線折算樣品溶液中葡萄糖濃度，按式（2）計算多糖含量。

式中：C——樣品溶液中葡萄糖濃度，mg/mL；D——稀釋倍數；f——換算因子；W——樣品質量，mg。

測定結果見表4。

表4 不同產地多糖含量的測定結果

序號產地藥材名稱多糖含量/% 1廣西西林縣鐵皮石斛6.30 2廣西桂平白石山鐵皮石斛4.15 3浙江溫州鐵皮石斛6.90 4廣西容縣都嶠山鐵皮石斛老條14.95 5廣西上林縣綠桿南山鐵皮石斛4.60 6廣西靖西縣樹上仿野生種植——南山鐵皮石斛5.32 7廣西大新縣紅桿南山鐵皮石斛8.81

3 討論

試驗以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法，通過紫外分光光度法測定不同產地石斛中多糖含量，對多糖的提取及精制參考了文獻[1-3]的提取方法。從7批不同產地石斛中多糖含量測定結果可以看出，產地對藥材中多糖的含量有明顯影響，其中含量最高的為容縣都嶠山（14.95%），最低的為廣西桂平白石山（4.15%），測量儀器為紫外分光光度計UV-2550，所測得的含量均高于最低檢測限。

4 結論

鐵皮石斛含有的多糖具有較好的藥理作用，試驗測定其中多糖的含量，對其質量控制及進一步產品生產具有參考意義，試驗所采用方法簡單可行、重現性好，建立了石斛多糖含量測定方法，可為石斛藥材的品質評價和質量控制提供指導。

參考文獻：

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