實驗原理
凝膠層析又稱凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動相中，因此以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數
Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。
通常選用藍色葡聚糖2000作為測定外水體積的物質。該物質分子量大（為200萬），呈藍色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質的分子量時，宜用藍色葡聚糖2000測定外水體積，因為它對激酶有吸附作用，所以有時用巨球蛋白代替。測定內水體積（Vi）的物質，可選用硫酸銨、
N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質。
本實驗使用血紅蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－魚精蛋白（DNP－魚精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通過Sephadex G－25層析后達到分離。
試劑和器材
一、試劑
0.9％ NaCl；10％ NaHCO3）；95％乙醇。
pH 7.0凝酸緩沖液（20mM磷酸二氫鈉：20mM磷酸氫二鈉＝31mL：69mL）
二、材料
血紅蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，離心棄去上層血漿。用0.9％NaCl洗血細胞數次（顛倒混勻，離心，棄去上清液），使離心后上清液幾乎無淡黃色為止。于洗凈的紅細胞中加入5倍體積的蒸餾水搖勻，離心去沉淀（破碎的細胞膜等）即為Hb稀釋液備用。
DNP－魚精蛋白溶液：取魚精蛋白0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此時該蛋白質溶液pH應在
8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微熱的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即傾入上述蛋白質溶液中。將此管置于沸水浴中煮沸5分鐘，注意防止乙醇沸騰溢出。冷卻后加2倍體積的95％乙醇，可見黃色的DNP－魚精蛋白沉淀。離心（300r/m）5分鐘，棄去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸餾水溶解，即為DNP－魚精蛋白溶液，備用。
三、器材
層析柱（1′15cm）；吸管1mL(′1)；滴管；攪棒試管
操作方法
一、凝膠的溶脹
取3克葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）干粉，浸泡于蒸餾水中充分溶脹（室溫6小時），或者于沸水浴中煮沸1小時后冷卻。充分溶脹后的凝膠以傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，如此反復洗滌 2～3次，最后加入等體積pH7.0磷酸緩沖液備用。
二、裝柱
取直徑1cm，長15cm的玻璃層析柱，垂直固定在鐵架臺上，將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約
5-7cm高的磷酸緩沖液，調節流速1滴/10秒；待柱中剩下約0.5cm磷酸緩沖液時，關掉恒流泵，把溶脹好的糊狀凝膠一次性倒入柱中，自然沉降20分鐘，在此過程中可以看到凝膠均勻地沉降到柱的底部并不斷地上升。20分鐘后，用鑷子小心在膠面上放置圓片濾紙，用滴管補加緩沖液（注意隨時添加緩沖液，防止柱床干裂）。同時開啟恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。若分次裝入凝膠，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面分層。裝柱長度至少10cm。
三、平衡
用磷酸緩沖液沖洗洗脫，平衡20分鐘。注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動。
四、樣品制備
取DNP－魚精蛋白溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即為上柱樣品。
五、上樣
待層析柱上緩沖液幾乎全部進入凝膠時，關掉恒流泵，用滴管將上述樣品沿柱內壁小心加到床表面，注意盡量不使平整的床表面攪動，然后打開恒流泵，讓樣品進入柱床。待其將進入柱床時，關掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸緩沖液至柱頂。
六、洗脫
旋緊柱頂，將進液管接入洗脫液瓶中，用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約每10秒一滴的流速，觀察并記錄Hb和 DNP－魚精蛋白在層析柱中的位置，并解釋之。
待所有有色條帶完全流出柱子后，繼續洗柱5 min。停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱頂螺旋，將凝膠倒回小燒杯中并取出濾紙片。
注意事項
（1）根據層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后柱床容積，計算所需凝膠干粉的重量，用洗脫緩沖液使其充分溶脹。
（2）層析柱粗細必須均勻，柱管大小可根據試劑需要選擇。一般來說，細長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內徑太小時，會發生“管壁效應”，即柱管中心部分的組份移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。
（3）各接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。
（4）裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導致層析過程中，凝膠床高度下降。
（5）始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。