不用Trizol即可裂解細胞提取RNA的方法

1、方法一
試劑：
（1）變性液組成：25 g異硫氰酸胍溶于33 ml CSB中（42 mmol/L pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 mmol/L β-巰基乙醇），65 ℃溶解，過濾滅菌，4 ℃預冷。
（2）酸性酚配制：55 ℃時，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復加500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸鈉，直到pH。
操作步驟：
（1）細胞收集：含一定濃度的細胞培養液置于無菌離心管中，4 ℃，3000 g離心5min；
（2）細胞洗滌：上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3000 g離心5 min；
（3）細胞破碎：在沉淀細胞中加入15毫升預冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿；
（4）在經變性液勻漿的細胞或組織600 μl＋60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器600 μl酚\氯-仿\異-戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10 s，冰浴10-15 min，離心，4 ℃，10000 g，20 min，上層水相吸至無菌離心管中，加等體積的異丙醇，-70℃，30 min沉淀RNA，離心4 ℃，10000 g，20 min；沉淀RNA，冷凍干燥15 min，RNA沉淀重新溶于300 μl變性液中.
可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65 ℃加熱，但時間應極短）60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器，600 μl酚\氯-仿\異-戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10 s，冰裕中10-15 min，離心，4℃，10000 g，20 min，上層水相吸至無菌離心管中，等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30 min），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥，復溶于去RNA酶的水中（對于準備長期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 mmol/L，再加入2.5體積的乙醇，-70 ℃保存）。

2、方法二
氯化鋰法提取總RNA 方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA-片斷丟失的缺陷。
試劑：
（1）氯化鋰/尿素溶液：氯化鋰126 g（3 mmol/L）尿素、360 g（6 mmol/L）加水至1 L，過濾滅菌
（2）懸浮液：10 mmol/L Tris-HCL （pH7.6），1 mmol/L EDTA （pH8.0），0.5%SDS

操作步驟：
（1）對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5-10 ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2 min，對于少量細胞（107細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5 ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉移至Eppendof管中；
（2）勻槳液在0-4 ℃放置4 h后，12000 g離心30 min；
（3）取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復步驟（2）；
（4）沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯-仿/異戊醇在室溫放置15－30 min并不時搖動混勻，4000g離心5 min；
（5）取上層水相，加1/10倍體積的3 mmol/L乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，-20 ℃放置1 h，5000 g離心；
（6）70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥；
（7）RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于-70℃保存。