不連續凝膠電泳色譜儀分析的不連續性表現在凝膠層、緩沖液離子組成、緩沖液pH和電位梯度的不連續。
一、凝膠層的不連續性：
1、樣品膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。樣品預先加在其中，起防止對流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中。目前電泳一般不制作此膠。
2、濃縮膠：為大孔膠，采用光聚合法制備。起防止對流的作用，樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面處濃縮成薄層。
3、分離膠：為小孔膠，采用化學聚合法制備。樣品在其中進行電泳和分子篩分離，起防止對流的作用。蛋白質分子在大孔凝膠中受到的阻力小，移動速度快。進入小孔凝膠時受到的阻力大，移動速度減慢。由于凝膠層的不連續性，在濃縮膠與分離膠的界面處使樣品濃縮，區帶變窄。
二、緩沖液離子組成的不連續性：
在電場中如有兩種電荷符號相同的離子向同一方向移動，其遷移率不同，兩種離子若能形成界面，則跑在前面的離子稱為快離子（前導離子），跑在后面的離子稱為慢離子（尾隨離子）。為了使樣品達到濃縮的目的，需在緩沖液中加入有效遷移率不同的兩種離子，并使這兩種離子在緩沖液中組成不連續的兩相，即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。為了保持溶液的電中性和一定的pH值，需加入一種與快、慢離子電荷符號相反的離子，稱為緩沖配對離子，使緩沖配對離子分布于全部緩沖液中，即三層凝膠緩沖液和電極緩沖液中。
如分離蛋白質時，通常采用氯離子（Clˉ）為快離子，甘氨酸根離子（(NH2CH2COOˉ）為慢離子，三羥甲基氨基甲烷（Tris+）為緩沖配對離子。
電泳開始前，慢離子位于兩個電極槽中，快離子分布于三層凝膠中，樣品在樣品膠中，緩沖配對離子分布于全部緩沖液中。電泳進行時，快離子與慢離子的界面向下移動。由于選擇適當的pH值緩沖液，使蛋白質的有效遷移率介于快、慢離子之間，而濃縮成為極窄的區帶。當樣品到達濃縮膠與分離膠的界面處時，離子界面繼續前進，蛋白質被留在后面，然后被分成多個區帶。
三、緩沖液pH的不連續性：
在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續性是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子比所有被分離樣品的有效遷移率都低，使樣品夾在快離子與慢離子的界面之間被濃縮。而在分離膠中，慢離子的有效遷移率比所有被分離樣品的有效遷移率都高，使樣品不再受離子界面的影響。
電極緩沖液pH = 8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小。濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大。蛋白質在濃縮膠中介于快、慢離子之間。電泳開始后，氯離子跑得zui快，留下一低電導區，產生高電位梯度，使甘氨酸根離子追趕氯離子，蛋白質夾在中間被壓縮。
四、電位梯度的不連續性：
在不連續體系中，電位梯度的差異是自然形成的。電泳開始后，由于快離子的遷移率zui大，會很快超過蛋白質，在快離子的后邊形成一個離子濃度低的區域即低電導區。由于電導與電位梯度成反比，低電導區的電位梯度較高。高電位梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。當快離子、慢離子和蛋白質的有效遷移率與電位梯度的乘積分別相等時，則三種離子的移動速度相同。快、慢離子的移動速度相等的穩定狀態建立后，在快、慢離子之間形成一個穩定而又不斷向正極移動的界面，即在高、低電位梯度區之間形成一個迅速移動的界面，由于蛋白質的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此就聚焦在這個移動的界面附近，被濃縮成一個狹小的中間層。