專家經驗談：如何減輕你的測序負擔

　　拷貝數變異（CNV）是指基因拷貝數出現的異常，主要表現為基因組大片段的缺失和重復。CNV是基因組結構變異的重要組成部分，與自閉癥、認知功能缺陷、癌癥等多種疾病有關。芯片是目前臨床上檢測CNV的主要工具，但芯片檢測在有些方面也是力不從心。舉例來說，芯片只能幫助我們判斷是否存在序列重復（或缺失），要獲得更加全面的信息只能求助于二代測序（NGS）。NGS可以達到更高的分辨率，還能同時檢出倒置、易位等其他結構異常，甚至為人們提供SNP和indel的信息。

　　不過，為了檢測CNV而測序整個基因組顯然有些大材小用。不少研究者選擇先富集自己感興趣的序列再進行測序，比如只占基因組1%-3%的蛋白編碼序列，或者與特定疾病有關的已知基因。這樣的策略可以節省大量的人力、物力和成本，受到了廣泛的歡迎。

　　CNV檢測的老大哥

　　如果需要檢測1Kb-3.5 Mb的染色體重復或缺失，研究者們一般選擇使用芯片。芯片是一種經濟實用的檢測方法，非常準確而且覆蓋度高，俄亥俄州立大學的助理教授Sameek Roychowdhury說。

　　不過芯片檢測也有一定的局限，雖然芯片的分辨率高于G顯帶染色體分析（核型分析），但卻檢測不到染色體重排（比如倒置和易位），也無法鑒定插入或缺失位點。

　　而NGS（不論是全基因組測序還是靶向基因組測序（比如全外顯子組測序）），“我們付出的越多，收獲也就越大。不論是全基因組測序還是靶向基因組測序（比如全外顯子組測序），都可以獲得SNP、indel以及染色體結構重排的準確信息，”這都是芯片檢測無法提供的，Roychowdhury說。

　　外顯子組測序

　　坊間流傳，隨著測序成本的直線下降，靶向測序的吸引力會越來越小。對絕大多數應用而言，全基因組測序取代靶向測序只是時間問題。不過就目前來看，這一天離我們還有點兒遠。我們在用NGS檢測CNV的時候，仍然需要權衡不同方法的優劣，盡量減輕測序負擔。

　　選擇蛋白編碼序列可以將人類基因組減少到35-70Mb，大約是整個人類基因組的2%。85%的已知致病突變發生在這個被稱為外顯子組的區域。制備測序用的外顯子組文庫也并不困難，市面上有許多商業化試劑盒可供選擇。

　　這些試劑盒大多以雜交為基礎，在特異性探針雜交之后進行PCR擴增。安捷倫的SureSelect、羅氏的NimbleGen’s SeqCap以及Illumina的Nextera都屬于這類試劑盒，只是DNA片段化方法（超聲法、酶處理等）或者探針指向的具體區域有所不同。這些試劑盒“對外顯子組的定義是不同的，”瑞士心血管遺傳學和基因診斷中心的Janine Meienberg博士說。她發現，沒有哪個平臺可以捕獲所有已知的外顯子，就算結合起來使用也做不到這一點。

　　還有一些試劑盒依賴于超多重PCR，將特異性的寡核苷酸作為PCR引物生成測序文庫。這類試劑盒大多是用一套特別的引物獲得PCR擴增版的外顯子組，比如Thermo Fisher的Ion AmpliSeq?。有的試劑盒使用分子倒置探針或鎖式探針（比如安捷倫的HaloPlex），這種探針能結合在目的片段的末端形成一個環，而其余的基因組片段被消化。

　　雜交法和多重PCR法各有優劣：雜交捕獲難以處理重復和高GC含量的基因組區域，而多重PCR法更適合5Mb以下的靶標區域。有個研究團隊發現雜交法會遺漏7%-10%的蛋白編碼序列，于是開始把這兩種方法結合起來使用。

　　Roychowdhury及其同事指出，不同外顯子組富集平臺在擊中率、均一性和SNP檢出方面存在差異，不過“這些方法檢測拷貝數變異都比芯片有效”。

　　任何涉及擴增的技術都有可能出現偏好，這也是NGS檢測CNV的一個潛在缺陷。數字PCR中的分液技術可以將多重化反應分成一個個單獨的反應，實現更加均一的擴增，減少NGS檢測中的偏好，Bio-Rad公司的Svilen Tzonev介紹道。

　　只測序你想要的

　　除了試劑盒以外，市面上還有一系列基于雜交或PCR的靶向富集panel。這種產品旨在幫助人們檢測一組特定的基因，比如與某種癌癥有關的基因。用戶們還可以使用廠家提供的設計軟件，根據自己感興趣的基因建立自定義panel。

　　最近，安捷倫發布了一體化的靶向序列捕獲產品OneSeq。該產品結合了外顯子富集所用的寬間隔探針與SNP芯片中密集的靶向性探針。OneSeq和安捷倫的免費軟件SureCall相結合，可以整合拷貝數變異、SNP、indel以及雜合性缺失的數據分析。

　　芯片、外顯子組測序和靶向性panel都是CNV檢測的實用技術，正可謂條條大路通羅馬。但對于探索性研究而言，“我們更傾向于全基因組測序，以便發現新的事物，”華盛頓大學的助理教授Vincent Magrini說。