專題：常用分子生物學實驗方法

*章 基因克隆 
1. 操作流程 
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體 
連接，取得連接產物 ——> 用感受態細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆鑒 
定（酶切法或PCR）——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆 
信息輸入數據庫——>質粒實物保存 
*章 基因克隆

2. 方法

2.1 設計引物 
引物設計要求：引物長度為25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm 
為70℃（±4℃），且兩條引物的Tm 相差不超過4℃。引物之間及引物本身避免形 
成穩定的二聚體或發夾結構，引物與模板不能有任何錯配。 
forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC 
reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC 
2.2 PCR 
2.2.1 PCR 反應體系 
模扳（100ng/ul 質粒） 2.00μl 
4dNTP（10mM） 1.00μl 
10×PCR Buffer 5.00μl 
MgCl2（25mM） 5.00μl 
5’Primer （10-12uM） 4.00μl 
3’Primer （10-12uM） 4.00μl 
5M 甜菜堿 10.00μl 
Pfu （5U/ul） 0.50μl 
ddH20 18.50μl 
*章 基因克隆 
總計 50.00μl 
2.2.2 PCR 反應程序 
1）從cDNA 文庫克隆基因 
Stage1 Stage2 Stage3 
1 Cycle 30Cycle 1 Cycle 
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 
2min 30sec 30 sec 
Xmin（2 
min/Kb） 
10min 1min 
注：Pfu 酶zui適延伸溫度為68℃。 
2）從含目的基因質粒中克隆 
Stage1 Stage2 Stage3 
1 Cycle 22Cycle 1 Cycle 
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 
2min 30sec 30 sec 
Xmin（2 
min/Kb） 
10min 1min 
2.3 割膠回收目的片段 
（QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit） 
1） 1%Agarose 膠電泳將目的DNA 片段用干凈的手術刀割下，放入1.5ml 離心管 
2） 稱重后，在1.5ml 離心管中加入3 倍膠體積的buffer QG（100mg 加300ul） 
3） 50℃水浴中放置10min（至膠完全溶解），每2-3 分鐘混勻一次（溶膠液應于 
buffer QG 顏色相同） 
4） 加入1 倍膠體積的異丙醇然后充分混勻，靜置片刻。 
5） 將樣品轉移入柱子中（柱子的zui大容量為800uL），然后13000rpm*1min 離心 
6） 取下柱子，棄流出液，將柱子放回到剛才那個收集管中 
*章 基因克隆 
7） 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室溫放置2-5min，然后13000rpm*1min 離心 
8） 取下柱子，棄流出液，再次13000rpm*1min 離心 
9） 將柱子放置在一支新的1.5mL 離心管中，加入50uL EB buffer （或無菌H2O） 
至膜中央，靜置片刻，然后13000rpm*1min 離心，然后測定濃度 
2.4 連 接 
在連接反應中通常要求： （目的基因分子數：載體分子數=3：1） 
連接反應體系 
sample + - 
10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl 
PGEM-T （50ng/ul） 1.00μl 1.00μl 1.00μl 
目的基因（150ng/ul） 1.00μl 1.00μl / 
T4 連接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl 
補水 6.50μl 6.50μl 7.50μl 
于16℃連接過夜。或室溫（25℃）1 小時以上。 
2.5 感受態細胞制備及轉化 
2.5.1 CaCl2 制備感受態細胞（DH5α 、DH10B、*0 ） 
1） 接過夜菌 在15ml 試管中加入3ml LB 培養基，從平板上挑取一單克隆接 
種，37℃，260rpm，培養過夜，約16 小時。 
2） 接菌 取2ml 過夜菌接入200ml 新鮮的LB 培養基， 37℃，260rpm，培 
養，直至OD600=0.4-0.5（一般約2 小時）,然后將菌液冰浴30-60 分鐘。 
3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，棄上清。 
4） CaCl2 懸浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸 
浮，冰浴10min。 
5）離心 4℃，5000rpm×5min，棄上清。 
*章 基因克隆 
6）CaCl2 懸浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min 即感 
受態制備完成。 
此時感受態可直接使用或冰浴過夜第二天使用或加入10%的滅菌甘油，混勻后 
-80℃凍存，以后使用（一般可存1 個月）。 
注： 制備感受態細胞要求嚴格控制溫度，制備過程在冰上操作。 
2.5.2 轉化（PGEM-T vector） 
1） 準備1.5ml 的離心管，冰浴預冷。 
2） 取100ul 感受態細胞，加入5ul 連接液，冰浴45-60min。 
3） 42℃熱刺激90sec。（此關鍵步驟，一定注意溫度及時間） 
4） 冰浴2min。 
5） 加LB 培養基900ul，37℃，150rpm 培養45-60min。 
6） 4000rpm×3min 離心。 
7） 留100ul 上清，棄多余部分，混勻，涂布到含氨芐青霉素的LB 板（預先涂 
布X-gal 和IPTG）。 
8） 37℃ 培養箱倒置培養過夜，約16 小時。 
2.6 接菌 
1） 轉化得到藍白菌落篩選板 （因為我們一般用的是PGEM-T 做連接，經X-gal 
處理后，有插入片段的顯白色；載體自連的顯藍色，因此得到篩選。） 
2） 挑取白色的菌落接到含氨芐青霉素的LB 培養基。 
3） 37℃，260rpm 培養。 
4） 培養5-6 小時后挑取2ul 菌液為模板做PCR 鑒定。 
5） 以PCR 結果，將有目的片段插入的樣品以5ml LB 培養基再次接菌，37℃， 
260rpm 培養過夜，約16 小時。 
2.7 陽性克隆鑒定 （PCR 鑒定） 
2.7.1PCR 鑒定體系 
*章 基因克隆 
10X Taq buffer 3 ul 
4X dNTP （10mM） 0.5 ul 
Taq DNA polymerase（5U/ul） 0.2ul（1U） 
10uM引物 （雙向） 各1ul 
50%DMSO（which is optional） 1ul 
模板：過夜菌液 / 挑單克隆 2ul 
加滅菌水至 30ul 
2.7.2 PCR 鑒定程序： 
94℃ 5min 
94℃ 30s 
30cycle 55℃ 30s 
72℃ 3min 
72℃ 10min 
4℃ +∞ 
30ul 上樣，走電泳（以100bp plus marker 為對照）→核對片斷大小 
2.8 質粒抽提 （質粒小量抽提試劑盒） 
1） 收菌 以10000 rpm ×1 min 離心收菌。（一般抽提一份用3-4ml 菌液） 
2） 棄上清。 
3） 加100ul 冰浴Solution I（含Rnase A），渦旋振蕩，使菌體充分懸浮。 
4） 加200ul Solution II，溫和混勻6 次。（此過程不超過5min） 
5） 加280ul Solution III，溫和混勻6 次。 
6） 以14000 rpm×10 min 離心。 
7） 取上清，過吸附柱，以10000 rpm×1 min，棄濾液。 
8） 吸附柱內加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，棄濾液。 
9） 反復步驟8）一次。 
*章 基因克隆 
10） 14000 rpm×1 min 離心。 
11） 將吸附柱旋轉180 度后再14000 rpm×1 min 離心。 
12） 加40ul 50℃預熱的ddH2O（或EB buffer）于吸附柱的膜中央，室溫靜置 
2min。 
13） 14000 rpm×1 min 離心并收集洗脫液，即質粒DNA。 
2.9 測 序 
1） ABI377 測序儀測序。 
2） 測序結果分析：用軟件Vector NTI Suite 6 分析測序結果。每個克隆相應的測 
序結果，分析結果，存儲信息分類輸入數據庫http://192.168.0.2/index.htm。 
克隆信息管理系統。將測序完成的克隆編號入庫。 
3. 基因克隆的編碼 
根據實驗基因引物的號碼相對應編制。 
如：基因引物編號： 1000_f 1000_r 
克隆編號： 1000A1 or 100092 
（注：號碼倒數第二位為日期編號： 1—9 為阿拉伯數字 10=A,11=B,12=C… 
zui后一位為克隆數編號，一般為1—3）