中性粒細胞堿性磷酸酶快速染色法的研究

  中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP)是一種胞內水解酶。測定其活性對于某些血液病的診斷、鑒別診斷和療效觀察有重要價值。目前國內推薦的改良Gomori鈣鈷法(簡稱改良法)，其孵育時間長達4 h，試劑配制繁瑣，我們將生物化學中有關磷酸基受體緩沖液的原理應用于NAP染色，即在改良法的基礎上，以2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)為緩沖體系，建立一種簡便快速染色法(簡稱快速法)，孵育時間只需15 min，報道如下。 
　　
    一、材料與方法

　　1.主要試劑：(1)固定液：10%甲醛甲醇溶液。(2)基質液：200 g/L β-甘油磷酸鈉溶液。(3)緩沖液(pH 9.6)：1.0 mol/L AMP溶液，內含鈣離子0.03 mol/L和鎂離子0.005 mol/L(用2 mol/L鹽酸調 pH)。(4)基質緩沖液(pH 9.6)：取上述基質液0.5 ml加入9.5 ml緩沖液中即可(臨用時配制)。

　　2.方法：(1)新鮮血片或骨髓片，干燥后用固定液固定10 s，流水沖洗晾干。(2)取已37℃預溫的基質緩沖液約1 ml均勻涂布血膜，37℃孵育15 min，水沖洗晾干。(3)20 g/L硝酸鈷溶液作用5 min，流水沖洗晾干。(4)10 g/L硫化銨溶液作用1 min，流水沖洗晾干。(5)5 g/L沙黃溶液復染5 s，沖洗晾干鏡檢。(6)結果判斷標準與報告方式同有關文獻［1］。

　　二、結果

　　1.方法學選擇：用NAP活性較高的血涂片染色，計數兩次求均值()作為統計學參數。(1)AMP濃度選擇用1.0 g/L β-甘油磷酸鈉配制不同濃度的AMP基質緩沖液，對同一份標本進行快速法染色，結果顯示當AMP濃度達到1.0 mol/L時，NAP積分和陽性率基本達到平衡。(2)β-甘油磷酸鈉濃度選擇用1.0 mol/L AMP緩沖液(pH 9.6)，配制不同濃度β-甘油磷酸鈉基質緩沖液，進行快速法染色，結果顯示當β-甘油磷酸鈉濃度達到10 g/L時，NAP積分和陽性率達到平衡。(3)筆者還對最適pH和最適溫度以及鈣、鎂離子濃度進行了選擇，結果以pH 9.6、37℃最適，鈣、鎂離子分別以0.03和0.005 mol/L為最佳。(4)最佳孵育時間的選擇：上述最佳條件對同一份標本孵育不同時間，繪制孵育時間積分及陽性率曲線，結果孵育15 min已達到平衡，且在2 h內基本穩定不變。

　　2.方法學評價：(1)120份標本同時進行快速法和改良法，經配對t檢驗，其NAP積分分別為97.7±8.4和96.5±10.6，差異無顯著意義(P＞0.05)。(2)重復性試驗：經實驗快速法批內和批間CV分別為0.029和0.052。(3)陰性對照試驗：將陽性標本經固定后置沸水煮10 min，染色結果陰性。(4)參考范圍：80例健康人參考范圍NAP積分為58.1(2～127)，平均陽性率34.2%(2%～74%)，與改良法相似。