中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

實驗材料 DNA 樣品

試劑、試劑盒 丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺過硫酸銨乙醇凝膠載樣緩沖液KOH 甲醇硅化液TBE 電泳緩沖液TEMED

儀器、耗材 夾子或鐵皮制紙夾電泳裝置玻璃板梳子和間隔片凝膠密封帶凝膠測溫條微量移液器及拉長的塑料洗頭凡士林注射器

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺（29:1) (%, m/V) 

過硫酸銨（10%，m/V）

乙醇

6X 凝膠載樣緩沖液

KOH/甲醇

硅化液（如 Sigmacote 或 Acrylease)(可選或不選）

5X TBE 電泳緩沖液

TEMED

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 樣品

3. 專用設備

夾子或鐵皮制紙夾（6~8 個，2 inch/5 cm 寬）

電泳裝置，玻璃板，梳子和間隔片

凝膠密封帶

凝膠測溫條（可選或不選）

微量移液器及拉長的塑料洗頭

凡士林

注射器（50 ml)

二、方法

安裝電泳裝置和配制凝膠溶液

1. 必要時可用 KOH/甲醇清洗玻璃板和間隔片。

2. 用溫熱的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，再充分漂洗，先用自來水，再用去離子水。應拿取玻璃板的邊緣部分或戴手套操作，以免手上的油脂殘留在玻璃板的工作面上。用乙醇沖洗玻璃板，并將其置于一邊晾干。

3. (可做可不做）其中一塊玻璃板的一面用硅化液處理（如 Sigmacote 或 Acrylease): 在化學通風櫥內，將玻璃板放于一疊紙巾上，倒少量硅化液于其表面上，用 Kimwipes 紙巾涂抹均勻，然后用去離子水沖洗、紙巾擦干。

4. 安裝玻璃與間隔片：

(1) 將較大的（不帶凹口）玻璃板平放在實驗臺上，在玻璃板的兩側將間隔片平行置于其邊緣放妥。

(2) 用凡士林輕涂以助于間隔片在后面的操作中保持原位。

(3) 將內板（帶凹口的玻璃板）在間隔片上放妥。

(4) 用夾子或鐵皮制紙夾將玻璃板夾在一起，將整塊玻璃板的兩邊及底部用凝膠密封帶封緊，形成不透水密封。

5. 根據玻璃板的大小和間隔片的厚度計算所需凝膠的體積。制備適宜濃度的凝膠溶液。

6. (可做可不做）將所需用量的聚丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰溶液放于一干凈的帶側臂的燒瓶中，加入磁力攪拌子，抽真空脫氣。開始脫氣應溫和一些，并邊脫氣邊旋轉燒瓶直至不再有氣泡溢出為止。

灌制凝膠

7. 下面的操作需要戴手套，在托盤上進行，以免濺出的丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺溶液灑在實驗臺上。動作應迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。

(1) 每 100 ml 丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺溶液中加入 35 μl TEMED, 輕輕旋轉混勻溶液。

(2) 用 50 ml 注射器吸取凝膠溶液，調轉注射器，排凈進入針管的空氣。將注射器的針頭插入兩塊玻璃板之間的空隙，注入丙烯酰胺溶液，幾乎注滿該空隙。

(3) 將玻璃板斜靠在試管架上，與實驗臺面成約 10° 角。

8. 立即將合適的梳子插入到凝膠中，小心勿使梳齒下留有氣泡。梳子的頂端應略高于玻璃板的上沿。用鐵皮制紙夾將梳子夾緊，使其就位。必要時，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充滿模具。確認無丙烯酰胺溶液從模具里漏出。

9. 丙烯酰胺于室溫聚合 30~60 min。若凝膠回縮明顯，應補加丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺溶液。

10. 聚合完全后，用 1X TBE 浸潤的紙巾包繞梳子和凝膠的頂部。然后用 Saran Wrap 膜密封整塊凝膠，4℃ 保存，直至使用。

11. 當準備好進行電泳時，在梳子的周圍及其頂部噴些 1X TBE 緩沖液，從聚合的凝膠中小心取出梳子。用注射器吸取 1X TBE 沖洗加樣孔。用剃須刀或解剖刀除去凝膠底部的密封膠帶。

上樣與電泳

12. 將凝膠放入電泳槽中，用大號鐵皮制夾子夾住其進緣或用裝置本身的夾子固定。帶凹口的玻璃板應面對緩沖液槽向里放置。

13. 用配制凝膠溶液同一批次的 5X TBE 配制電泳緩沖液灌滿緩沖液槽。用一根彎頭巴斯德吸管或注射器針頭排除藏匿于凝膠底部的氣泡。

14. 用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1X TBE 沖洗加樣孔。將 DNA 樣品與適量 6X 凝膠載樣緩沖液混合，用 Hamilton 注射器或帶有拉長的塑料吸頭的微量移液管加入加樣孔。

15. 將電極與電源相連（正極接下槽)，打開電源，進行電泳。

16. 電泳至標準參照染料遷移至所需位置。關閉電源，拔掉插頭，棄去電泳槽中的電泳緩沖液。

17. 卸下玻璃板，用解剖刀或剃須刀片除去凝膠密封膠帶。將玻璃板放在實驗臺上 （硅化的玻璃板在上面)。用間隔片或塑料楔將上面的玻璃板的一角撬起。檢査一下凝膠仍應附著在下面的玻璃板上。將上面的玻璃板平穩的移開，去掉間隔片。

18. 檢測聚丙烯酰胺凝膠中 DNA 條帶的位置。