3.中空纖維濃縮病毒培養液實例
相對于其他雜蛋白和DNA等雜質，病毒顆粒具有較大的分子量，因而可以使用超濾膜過濾和分子篩等技術按照分子量大小進行分離分級，建立通用的病毒純化工藝。病毒類疫苗通常使用微載體細胞培養技術進行病毒培養，一定滴度的病毒培養收獲液通過 1-2um玻璃纖維GF澄清過濾去除細胞碎片和部分 DNA，超濾膜濃縮 10-80倍，經滅活水解之后使用 Sepharose 4FF或 6FF分子篩層析按照分子量大小進行精細純化[16] 。
圖 3 通用的病毒疫苗生產工藝
病毒超濾濃縮通常使用 100-300k膜包，膜包篩網剪切力易造成病毒顆粒聚集和表面蛋白的脫落，從而影響病毒活性收率，因此對操作要求極高；此外，膜包篩網剪切力還容易加速雜蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k較小的膜包孔徑不利于濃縮過程中雜蛋白透過，因此濃縮液雜蛋白含量在濃縮過程中不斷增加，蛋白凝膠層顯著影響濃縮處理速度，較高的黏度也不利于后期4FF分離純化和填料壽命。
3.1 狂犬病毒培養液的濃縮
狂犬病毒屬于彈狀病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是誘發細胞與體液免疫的主要抗原物質[17] 。超濾濃縮過程中需要盡量溫和以避免G蛋白的脫落，保護病毒的免疫原性，同時盡可能去除雜蛋白和 DNA片斷。
3.1.1 實驗條件
樣品：澄清病毒收獲液 (CTN株，Vero細胞 Cytodex 1微載體連續 培養，Lot20090401)
實驗設備：Quixstand 中空纖維衛生級超濾系統（可整體高壓滅菌）
AKTA Purifier10 層析儀
中空纖維超濾柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2 (750kDa MWCO，GE)
Cassette 300k膜包0.1m2（某進口品牌）
檢測方法：LD50病毒滴度(藥典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目測外觀
3.1.2 實驗結果
我們分別使用中空纖維 750k超濾柱(GE)和 300k超濾膜包(某進口品牌) 進行狂犬病毒收獲液的濃縮，考察處理速度、病毒顆粒收率和濃縮液澄清度等指標。除病毒滴度外，濃縮液使用Sephorase 4FF 16/40分子篩分析柱進行分析，快速檢測比較雜質殘留。
表1狂犬病毒培養液超濾濃縮實驗條件 
* 指開始濾洗時的濃縮倍數
使用 750k中空纖維和 300k膜包濃縮過程的通量-透過體積曲線見下圖(Flux-Permeate Vol)。使用中空纖維 750k超濾柱進行狂犬病毒培養液濃縮，濃縮 20倍然后濾洗 3倍，整個過程需要 1小時 16分，平均處理通量 61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k進行濃縮，濃縮20倍然后濾洗3倍，整個過程歷時 1小時 20分，平均處理通量 49 LMH。
