中藥中非法添加化學藥物的檢測研究進展（二）

中藥非法添加劑檢測案例

這里以近期出現的降糖保健食品中非法添加鹽酸苯乙雙胍和格列本脲事件為例，說明HPLC-MS在中藥非法添加劑檢測中的應用。

鹽酸苯乙雙胍和格列本脲分別屬于雙胍類和磺酰脲類降糖藥物，在臨床上應用廣泛，療效確切而且價格低廉，但也具有一定的毒副作用，鹽酸苯乙雙胍由于乳酸性酸中毒的不良反應比較嚴重，相繼在許多國家停用，而格列本脲可造成低血糖癥以及其他一系列如腎上腺皮質功能減退、致畸等嚴重不良反應。然而一些不法廠家為了增強降糖效果，將其摻入其生產的降糖保健食品中，患者如在不知情的情況下大量服用，其后果是極其嚴重的。這里建立了一種準確可靠的分析方法對非法添加該些化學物質進行檢測，并對9批市售的降糖保健食品進行檢測，結果發現3批膠囊非法摻入了鹽酸苯乙雙胍和格列本脲。

1.薄層法初篩

1.1格列本脲的薄層定性鑒別

對照品溶液的制備：精密稱取格列本脲對照品適量，加氯仿溶解并稀釋制成每1ml中含1mg的溶液。

供試品溶液的制備：取10粒膠囊內容物混勻，精密稱取約3g，加氯仿50ml超聲處理30min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加氯仿5ml使溶解，即得。

點樣及展開：吸取對照品溶液、供試品溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的SGF254薄層板上，以三氯甲烷-環己烷-乙醇-冰醋酸（8：13：1：1）為展開劑，上行展開。

檢視：將展開后的薄層板取出，晾干，置于紫外燈254nm波長下檢視，結果9批樣品中有3批在與對照品色譜相應位置上顯相同的紫紅色斑點， Rf值約為0.36。結果見圖1。

1.2鹽酸苯乙雙胍的薄層定性鑒別

對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸苯乙雙胍對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml中含5mg的溶液。

供試品溶液的制備：供試品均為膠囊，取10粒內容物混勻；精密稱取約3g，加甲醇50ml超聲處理30min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，即得供試品溶液。

點樣及展開：吸取對照品溶液、供試品溶液各5μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的SGF254薄層板上，以氯仿-甲醇（4：1）為展開劑，上行展開。

圖2.  鹽酸苯乙雙胍薄層色譜圖。

檢視：將展開后的薄層板取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀溶液顯色，結果9批樣品中有3批在與對照品色譜相應位置上顯相同的橙紅色斑點， Rf值約為0.52。結果見圖2。

2. HPLC/二極管陣列定性鑒別

2.1色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（200×4.6mm，5μm）；流動相A相為乙腈，B相為0.02mol/l的醋酸銨溶液（含0.1%冰醋酸）-乙腈-甲醇（60：20：20），0~2min，100%B相，2~5min，A相0%~60%，B相100%~40%，5~15min，A相60%，B相40%；流速為1.0ml/min；檢測波長為235nm；柱溫為25℃；進樣量為20μl。

2.2對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸苯乙雙胍和格列本脲對照品適量，加B相溶解并稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備：供試品均為膠囊劑，取10粒內容物混勻；精密稱取約0.3g，置50ml量瓶中，加B相適量，超聲15min后，加流動相稀釋至刻度，搖勻，13000rpm離心10min，取上清液，稀釋10倍進樣。

2.4精密量取上述兩種溶液各20μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果9批樣品中有3批出現與對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰。

圖3.  高效液相色譜－二極管陣列光譜圖，左為鹽酸苯乙雙胍，右為格列本脲。

2.5采用二極管陣列檢測器進一步對其光譜圖進行確證，結果見圖3。3批陽性樣品色譜峰的DAD光譜圖與對照品基本一致，且其峰純度均大于900。

3. LC/MS/MS定性確認

3.1色譜條件同2.1，分流進樣，分流比為10：1。質譜檢測參數：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測，掃描范圍100~600m/z。電噴霧參數：霧化氣壓力15.0psi，干燥氣（N2）溫度325℃，流速5.0 L/min，靜電噴霧電壓4000V，碰撞電壓2.5V。

圖4.  LC/MS/MS 圖譜，A 為鹽酸苯乙雙胍對照品一級質譜圖，B為鹽酸苯乙雙胍對照品二級質譜圖，C為格列本脲對照品一級質譜圖，D為格列本脲對照品二級質譜圖，E、G為樣品一級質譜圖，F、H為樣品二級質譜圖。

3.2取2.2，2.3的對照品溶液和供試品溶液各5μl注入LC/MS聯用儀，分別記錄一級（圖4A、4C、4E、4G）、二級質譜圖（圖4B、4D、4F、4H）。結果3批陽性樣品保留時間約4min和8min處色譜峰的一級、二級質譜圖均與對照品完全一致。根據質譜所提供的相對分子質量和碎片信息，可以確證色譜峰分別為鹽酸苯乙雙胍和格列本脲。 

新聞事件回放

2009年 1月17日和19日，新疆喀什地區兩名糖尿病患者服用標識為“廣西平南制藥廠”的“糖脂寧膠囊”（批號為081101）后死亡。經查，廣西平南制藥廠未生產過批號為081101的“糖脂寧膠囊”，致人死亡的藥品為假冒產品。經新疆藥品檢驗所檢驗，非法添加化學物質“格列苯脲”和“格列吡嗪”，其中每粒含有“格列苯脲”化學物質最高達12.3mg。“格列苯脲”降糖作用比較強，但嚴重超量有可能造成休克，甚至死亡。