以往臨床化學實驗都采用比色法進行各個項目的測定,這是因為比色法具有微量、迅速、準確的優點,特別適合于微量的生物體體液中各項物質測定。
在一般比色法中,手工使用比色計或分光光度計可以測定各種反應溶液的吸光度,但由于很難控制測定時間和反應溫度,很難準確記錄反應過程中吸光度變化,因此,毫不奇怪在很長一段時間內我們所使用的方法,都是在呈色反應達到完全或者反應達到平衡時,吸光度達到穩定時才進行測定。即所謂平衡法或終點法。
但自從自動生化儀出現后,從根本上改變了上述情況。通過各項先進技術,人們可以精確測定反應的動態過程。并可以準確計算任何一段反應時間內的反應速率,這樣大大開闊了臨床化學家對方法的選擇。除經典的終點法外還可以進行動態測定。這樣不僅縮短了操作時間,大大提高了工作效率,還可進行一些用常規比色方法不能進行的測定。如測定酶反應的初速度(Vo)等等。測酶初速度(Vo)只能用分光光度法。
因此,用好自動生化儀一個重要前提必須對自動生化儀可以提供的測試方法類型有所了解。
生化自動分析儀特點:
1 精確測定反應的動態過程;
2 準確計算任何一段反應時間內的反應速率;
3 除經典的終點法外還可以進行動態測定。
在臨床化學中絕大多數方法都是所謂物理——化學方法。也就是將所測定物質進行一些化學轉化后再進行測定。
絕大多數化學反應都經歷一個類似圖1的反應過程。
圖中虛線明顯將反應分為二個截然不同時期,左面期中所測的產物濃度在不斷變化之中,由傳感(Sensor)所得到的信號也在相應改變之中。如所用的方法主要是根據這期間所獲得的信號進行計算,這稱之為動態法。
相應在圖中虛線右邊時期,傳感器所得到信號相對不變,如根據這些信號計算的方法稱之為平衡法。從科學上說此術語顯然比終點法更為確切,因為信號無變化,不一定意味著反應完全達到終點。
正因為在這期內傳感器所得到信息變化不大,因此對測定的條件如時間,濃度,PH等要求遠沒有動態法那樣嚴格,所以不要求特殊儀器,而且精密度較高,非常適宜于一般儀器和實驗室使用。
圖1也同樣適用于酶催化的反應,在動態期酶所催化產化的物質處在一個動態變化之中,在酶作用一段時間后,由于基質消耗逆反應出現,底物的抑制作用等,反應速率愈來愈慢,最后達到平衡期。此時基質和產物濃度不出現變化,因此很清楚如要測酶活性,只能在動態期測定酶所催化反應的速率。所以嚴格說測酶方法不論用自動生化儀,記錄或分光光度計或普通比色計都包括在動態法的范圍內。
平衡法(終點法)
這是目前我國生化實驗室常用也是大家所熟悉的方法。其特點是對測定條件尤其是測定時間和溫度要求不嚴格,所以容易掌握,計算結果方便,精密度好,但由于反應達到平衡需要一定時間,一般都需十分鐘以上,因此整個操作時間長,工作效率低,目前不少自動生化儀特別是離心式分析儀改用動態法。即使采用平衡法時也對方法進行修改,設法縮短動態期。例如同是糖激酶——葡萄糖—6—磷酸脫氫酶法測血糖,手工法往往需15分鐘后比色,但在自動生化儀中由于加大工具酶用量,在3分鐘內就達到終點。另外應用計算機技術在每一個標本達到平衡時就可分別進行終點測定。
近年來有一種傾向就是將特異性較差的化學法改為特異性酶法。即以酶作為試劑來測定血中各種代謝物質。這類方法和經典的平衡法有所區別,下面做一個簡單敘述:
這類方法特點是被測物質(酶反應的基質)在酶反應過程中完全被轉化或消耗掉(即達到反應終點),通常這類方法操作簡單,一般不需要作標準管,通過一些已知的理化常數例如克分子吸光系數等不難將結果計算出來,其缺點是反應時間較長,特別不適合于離心式自動分析儀。另有少數酶反應,基質并未完全消耗掉,只是達到一個動態平衡,此時往往需要同時作標準管。
動態法(連續監測法)
動態法——即根據某一物質對一個反應的催化或延緩作用來測定期含量,這是通過秒表測量反應延緩時間而達到此點。
從六十年代開始,動態法得到迅速發展,這是由于一系列高技術發展的結果:出現了高質量的電化學和比色傳感器,溫度控制的比色杯,迅速混勻技術,以及自動數據處理系統等,人們避免了繁雜的計算,可以迅速直接得到測定結果,滿足了臨床醫學大量生化標本的要求。反之動態法的使用也大大推動臨床化學發展,僅用有限人力可以測定成十倍原來的工作量。如測酶活性全部使用此方法。