(一)標本的采集
常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時,應使用一次性密閉容器,如真空采血管。當使用非密閉采樣系統時,如尿、分泌物和骨髓的采樣,必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應高壓處理,因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌,250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝,因為肝素是Taq酶的強抑制劑,而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。
臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理,并盡快(3小時以內)分離血漿,以避免RNA的降解。如未作抗凝處理,則抽血后,必須在1小時內分離血清。
(二)標本的穩定化處理
用于DNA擴增檢測的標本,采集后一般不需要特殊的穩定化處理,但標本應及時送至實驗室。
由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化處理,如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集標本時,可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中,從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化處理后,標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目,上述穩定化處理方法的效果究竟如何,要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。
(三)標本的運送
標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化處理的標本。通常在運送時,應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本,如果未經穩定化處理,則必須速凍后,放在干冰中運送。
(四)標本的貯存
臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。
(五)標本的處理(核酸提取)標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟,在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前,應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常,核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致,抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產物)或核酸提取過程