臨床檢驗技術發展及其在耐藥基因檢測中的應用進展

劉曉燕 (公安縣人民醫院檢驗科，湖北公安434300)
王 紅 (湖北中醫藥大學醫學檢驗與技術學院，湖北武漢430065)

[關鍵詞] 臨床檢驗技術；耐藥基因；分子生物學技術

一份準確全面的醫學檢驗報告是醫生做出準確診斷與制定正確治療方案必不可少的依據。因此，臨床醫學檢驗是一門極其重要的醫學學科。筆者對臨床醫學檢驗技術的發展狀況及新技術在細菌耐藥基因檢測中的應用作簡要綜述。

1 臨床檢驗技術的發展特點

2O世紀4O年代前，我國醫學檢驗基本上為一片空白，大多數醫院未設立專業的檢驗科室或只是開展極其簡單的檢驗項目。5O年代才開始有醫學檢驗專業。1982年，我國正式成立衛生部臨床檢驗中心，為國內外臨床檢驗質量控制方法和質量管理經驗交流建立了平臺，使國內的臨床檢驗走上了規范化和標準化的道路。近二十年來，隨著科學技術的發展和計算機技術的廣泛滲透，最新的生物技術和生物信息研究成果不斷地進入到臨床實驗室。現代臨床檢驗技術主要有以下特點。

1．1 檢驗技術操作的自動化程度日益提高現代臨床檢驗醫學已經從以前的手工操作和簡單的生化測試方法，轉變成今天的全自動化設備，能夠檢測多種生化、免疫等指標，并能檢測疾病相關基因，成為一門涉及多領域的學科。在現代臨床檢驗實驗室中，全自動生化測試儀、全自動血細胞分析儀、自動凝血儀、自動免疫測試儀、質譜儀等已經成為不可缺少的組成部分。現代化儀器的使用，加快了臨床檢驗發展的速度，提高了準確率和精確度，同時減輕了工作人員的勞動強度。

1．2 免疫標記技術、熒光技術和分子生物學的迅速發展 8O年代后期至9O年代，免疫比濁測定、凝集試驗、沉淀試驗發展到免疫熒光技術、放射免疫技術、酶免疫試驗、化學發光免疫技術、膠體金和膠體曬免疫技術、蛋白質印跡、蛋白質芯片、蛋白質飛行質譜和流式細胞技術紛紛應用于臨床，大大提高了檢測靈敏度和檢測范圍。2O世紀中期開始，分子生物學拉開序幕，從DNA雙鏈結構的發現，限制性核酸內切酶的應用，到DNA測序方法的成熟和PCR技術的誕生，分子生物學的發展使生物醫學研究和臨床診斷進人了一個新的時代 。

2 分子生物學技術在耐藥基因檢測和定位中的應用

2．1 聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種快速在體外從某種來源的模板DNA 中擴增目標DNA的通用方法，是最常用的分子生物學技術之一。可用該技術對細菌核酸內已知的耐藥性基因進行篩查和驗證。利用商品試劑盒從細菌中抽提的基因組、質粒，純度和濃度均很高，可作為穩定的DNA模板，通過挑取菌落煮沸裂解直接得到細菌DNA模板，方便快捷，適合大批量地進行耐藥基因篩查[2]。引物的特異性以及擴增體系和條件對于PCR的特異性和敏感性非常重要，每次實驗中均應包含陽性對照樣本和陰性對照樣本。

2．2 核酸雜交核酸雜交(molecular hybridization)是分子遺傳學的基礎研究工具，利用的是單鏈核酸分子問能退火形成雙鏈分子(tO就是雜交)的能力。能形成雙鏈分子的單鏈分子間必須有高度的堿基互補配對。通常是利用一段被標記的核酸分子作為探針(probe)，在許多未經標記的核酸分子混合物中鑒別同源DNA或RNA分子。通常將細菌菌落直接轉移到濾膜上雜交，探針可采用同位素、地高辛或者生物素標記。核酸雜交還可以用于耐藥基因定位。將細菌抽提出的質粒通過瓊脂凝膠電泳、轉膜并用特異性耐藥基因探針進行雜交，觀察質粒在電泳圖上的位置是否存在雜交信號可以判斷該耐藥基因是否定位于質粒[3]。

2．3 酶切克隆PCR和核酸雜交只能對已知的耐藥基因進行篩查和驗證，如果需要尋找未知的耐藥基因，可以利用酶切克隆和抗生素篩選的方法。通常對于具有抗生素耐藥表型的細菌，首先挑選合適的片段連接人載體(如質粒，噬菌體)，通過該耐藥表型抗生素篩選重組子可以獲得攜帶耐藥基因的質粒，最后對所獲得的質粒進行測序，明確耐藥基因的具體信息[4]。實驗的關鍵點是所挑選的內切酶必須有比較合適的切點，即酶切片段大小要適中，片段太長不易連接入載體，而片段太短則不能包含完整的基因序列，導致缺乏耐藥表型[5]。

2．4 全基因組測序隨著測序技術在近幾年的飛速發展，獲得一個物種的全基因組序列已經不是非常困難的事情，特別是相對簡單的細菌基因組。明確耐藥株的核酸全序列之后，．可以在基因組的水平對基因分布、代謝途徑、調控通路有一個全局性認識，特別是可以明確耐藥基因的進化和傳播機制，深入了解目前廣泛存在的細菌泛耐藥問題。比較傳統的方法是先構建全組基因組DNA文庫，利用載體克隆大量的文庫DNA片段進行毛細管電泳測序，再將測序片段進行拼接以獲得完整的基因組全長[6]。

近兩年來，基于芯片技術的新的全基因組測序技術也已興起。Smith等口 運用此技術成功地完成了全長3976746個堿基對對的鮑曼不動桿菌基因組測序工作。
隨著分子生物學技術的不斷發展，其在細菌耐藥性研究中的應用日益廣泛，將對揭示細菌耐藥性產生及流行的分子機制，控制耐藥細菌流行播散發揮日益強大的作用。

[參考文獻]

[1]許敏．美國臨床檢驗醫學進展的借鑒EJ]．首都醫科大學學報，2007，28(2)：182—184．
[2]Cattoir V，Poirel L，Rotimi V，et a1．Multiplex PCR for detection of plasmid—mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL—produ—cing enterbacterial isolates[J]．J Antimicrob Chemother，2005，49：3091—3094．
[3] Poirel L，Van De Loo M，Mammeri H， a1．Association of beta—laetamase VEB一1[J]．Antimjcr0bAgents Cbemother，2005，49：3091-3094．
[4]Hata M，suzuki M，Matsumoto M，eta1．Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in shigella flexne—ri 2b[J]．Antimicrob Agents Chemother，2005，49：801-803．
[5]俞去松．分子生物學技術在細菌耐藥性研究中的應用[J]．中華檢驗醫學雜志，2008，31(6)：610—613． ．
[6]Jin Q，Yuan Z，Xu J，et a1．Genenome sequence of Shigella flexneri 2a：insights into pathogenicity through comparison with genomesof Escherichiacoli K12 and O157[J]．Nucleic Acides Res，2002，30：4432—4441．
[7] Smith MG，Gianoulis TA，Pukatzki S，et a1．New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis reveald by high—density pyrose—quencing and transposo mutagenesis[J]．Genes Dev，2007，21：601—614．