很多時候檢測不到目的條帶的問題竟都是出在樣本制備這一步。質粒有沒有轉染到細胞中去，轉進去后有無表達，表達量是否足以用 WB 檢測，目的蛋白是否容易降解？想要得到最佳實驗結果，了解清楚這些問題比一遍一遍優化和改進 WB 操作本身更為重要。
相信若非首次接觸 WB 實驗的科研同行，每人都應有一套成熟的實驗方案可行而有效，若目的蛋白檢測不到，可適當根據 CST 推薦的操作步驟優化調整，但更需要的，還是在蛋白制備上下功夫，可參考如下：
1. 選擇最佳轉染方法。
2. 檢測 mRNA 水平。
3. 提取蛋白的細胞裂解液中加入蛋白酶抑制劑防止蛋白降解；如果需要檢測磷酸化蛋白，請加入磷酸酶抑制劑。
4. 測定蛋白表達量，低表達的蛋白需要濃縮目的蛋白樣本至可檢測濃度, 確認你的上樣量達到 20 μg。
5. 考慮刺激處理是否合理。
6. 通常我們建議采用超聲處理細胞和組織提取物，而且超聲對于研究細胞核和核染色質相關蛋白至關重要，如組蛋白 H3。