九大測序平臺對比（一）

1.Sanger
2.454
3.Solid
4.HiSeq2000
5.Helicos
6.DNA Nanoball array
7.The PacBio RS system
8.PGM
9.MiSeq


  sanger
企業：Life Technology
推出時間：1977年發明，1986年第一臺商業化測序儀
主流型號：3730XL
樣品要求：PCR產物：濃度≥50ng/ul 體積≥10ul；質粒：含量≥5ug；菌液：體積≥1ml。
測序原理:
雙脫氧鏈終止法：Sanger法測序的原理就是，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾個至千以上個，相差一個堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
文庫制備:無需建庫，提供質粒、菌液、PCR產物等均可以
模板制備:PCR擴增
讀長:500-1000bp
測序通量:
四種測序方式的每天通量：
短片段測序36cm36min500bp  1,728,000bp/day；
快速測序36cm60min700bp   1,440,000bp/day；
標準測序36cm90min800bp   1,113,000bp/day；
長片段測序50cm120min1100bp  1,002,000bp/day。
(36cm指毛細管長度，36min指一次反應時間，500bp指一個反應的讀長；)
時間/run:36 min-2 hours
堿基精確度:99.999%
變異檢測能力(DNA重測序方面):
heterozygous insertions and deletions,microsatellite, SNP, AFLP, T-RFLP,and LOH analyses
AFLP：擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism),；
T-RFLP：限制性片段長度多態性（terminal restriction fragment length polymorphism）；
LOH analyses：雜合性缺失（Loss of Heterozygosity）；
成本:$95,000 per machine, about $4 per reaction, 800bp per reaction,
數據格式:*.bcf  ； *.abl
分析軟件:
數據收集軟件Data Collection v2.0 (隨機提供)
Manages your instrument setup, controls instrument operations, allows real-time data visualization, and performs diagnostics. New features include:
- Auto-analysis with GeneMapper? v3.5 and SeqScape? v2.1
- FDA 21CFRpart 11 compliance (for US customers)
- Flexibility to use any choice in dye set option
- Additional optimized sequencing run modules covering more applications
序列分析軟件Sequencing Analysis v5.1
Designed to base-call; assign quality values; trim, display, edit and print DNA sequencing data using the KB basecaller
序列拼接和比較基因分析軟件Seqscape? v2.1
Provides everything you need to perform resequencing applications such as VariantSEQr? Resequencing System
自動化基因片段分析軟件GeneMapper? v3.5
Enables configurable, automated allele calling -- a plus for high-throughput genotyping and includes tools for SNPlex? data analysis
SNP分型數據管理軟件BioTrekker? v1.0 (optional data-mining tool)
Provides a fast, powerful way to search for, retrieve, and manage millions of genotypes
優點:測序金標準，讀長長
缺點:通量低，成本高
經典案例:Sanger測序屬于測序技術的金標準，文章眾多
備注:鑒于測序本身方法的局限，測序引物后10bp～40bp無法保證準確




454
企業: Roche
推出時間: 2005年
主流型號: Genome Sequencer FLX Titanium（2008年推出）
樣品要求: 5 μg of DNA，濃度≥300 ng/μL
測序原理：焦磷酸測序
在測序時，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。
文庫制備：Fragment(300-800 bp), Mate-pair
模板制備：微乳液PCR
讀長：400bp
測序通量：0.4-0.6 Gb/run
時間/run：10 hours
堿基精確度：Q20讀長為400個堿基
變異檢測能力(DNA重測序方面：SNP, Indel, SV, CNV
成本：儀器$500,000/臺，測序$5,600 per whole plate
數據格式：Raw data：SFF格式
分析軟件：GS De Novo Assembler軟件；GS Reference Mapper軟件；GS Amplicon Variant Analyzer軟件
優點：突出優勢是讀長長，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。速度快，一個測序反應耗時10個小時，獲得4-6億個堿基對。
缺點：無法準確測量同聚物的長度，所以檢測插入缺失突變的誤差率高；通量小且費用高。
經典案例：1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.
(更多詳見https://www.roche-applied-scienc ... ng/genome/index.jsp)
備注：特別適合從頭拼接和宏基因組學應用，多用于新的細菌基因組。對重測序來說太貴，不適合




Solid
企業: Life Technology(2008年，ABI與Invitrogen合并為Life Technology公司)
推出時間: 2007年
主流型號: Solid?4.0（2010年推出）
樣品要求:
? Fragment文庫10 ng-5 μg
?Paired-end文庫10 ng-5 μg
?Mate-paired文庫5 μg-20 μg
測序原理: 邊連接邊測序
測序引物與接頭可以互補雜交，其5‘端可與和鄰近序列互補的寡核苷酸相連。八聚體寡核苷酸可競爭性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標記位點）。當其標記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標記，進行下一輪反應，以此依次循環。在第一輪反應中，可以得到確定的堿基位點為：4、5、9、10、14、15位堿基等。重復該反應過程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個堿基的引物進行反應，可以確定的堿基位點包括：3、4、8、9、13、14等，如此往復，直至偏移至引物的第一個堿基（即待測序列0位點堿基）。由于該位點堿基已知，可通過讀取的熒光顏色得知位點1的堿基類型，然后，又以位點1堿基熒光顏色推知位點2的堿基類型，依此類推，直至整個序列讀序完成。
文庫制備:
? Mate-paired 文庫 (插入片段 600 bp to 10 Kb)
? Paired-end 文庫
? Fragment 文庫
模板制備: 微乳液PCR
讀長: 2*50 bp
測序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day
時間/run: 7~12 days
堿基精確度: 原始堿基數據的準確度大于99.94%，而在15X覆蓋深度時的準確度可以達到99.999%
變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP, Indel, SV, CNV
成本: 儀器$495,000/臺，測序$6000/100Gb
數據格式: Raw data: *csfasta和*quel；比對輸出格式：BAM/SAM。
分析軟件: 分析軟件：Bioscope,比對后格式有很多第三方軟件支持
優點: 高準確性，每個DNA堿基檢測2次，增加了序列讀取的準確性
缺點: 運行時間長，檢測堿基替換突變的誤差率高
經典案例: SOLiD測序技術僅在DNA應用發表的文章共60篇，包括發表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中de nove sequencing文章3篇，targeted resequencing文章26篇，whole genome resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表觀等文章應用也同樣廣泛。
備注: 行業領先的準確性實現了重要的生物變異檢測，適合全基因組重測序、定向重測序和全轉錄組分析等應用。




HiSeq2000
企業: Illumina
推出時間: 2010/1/1
主流型號: Illumina HiSeq2000
樣品要求: 6ug/sample,無RNA、蛋白污染，無降解，OD260/OD280=1.8-2.0
測序原理: 邊合成邊測序
這種測序技術通過將基因組DNA的隨機片斷附著到光學透明的表面，這些DNA片斷通過延長和橋梁擴增，形成了具有數以億計cluster的Flowcell，每個cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標記的堿基進行邊合成邊測序。這種新方法確保了高精確度和真實的一個堿基接一個堿基的測序，排除了序列方面的特殊錯誤，能夠測序同聚物和重復序列。This technology attach random fragment of genome DNA  to optically transparent surface.And by extention bridge amplification of the DNA fragments,it create a flow cell with > 10 million clusters, each containing ~1,000 copies of same template. Then sequence by synthese using four kind of terminal-closed base with different fluorescent mark. This technology assures the high accuracy and one by one base sequencing, avoids special mistakes of sequence and can be applied for repeated sequence and homopolymer.
文庫制備: Fragment, Mate-pair (200bp-40kb)
模板制備: 橋式擴增
讀長: 50SE,91PE,101PE 等
測序通量: 25G/day
時間/run:
91/101PE, 8-10 days ;
50SE, 3 days;
150PE, 15 days;
總體來說，策略不同，時間也有差別
堿基精確度: Q30%≥80%；Q20%≥90%
變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP、Indel、SV、CNV
成本: $690,000 per machine , $6000 per human genome sequencing(30X)
數據格式: 測序結果：*.fq;比對：*。SOAP/*.BAM/*.SAM;變異：*.gff
分析軟件: GenomeStudio或者第三方軟件包；自主選擇
優點: 通量大，測序方式靈活，分析軟件多樣化
缺點: 在成本上目前高于第三代測序，樣本制備過程復雜，樣本要求相對 較高。
經典案例: Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma.Chapman MA,et al.Nature. 2011 Mar 24;471(7339):467-72.
Cytoplasmic intron sequence-retaining transcripts can be dendritically targeted via ID element retrotransposons.Buckley PT,et al.Neuron. 2011 Mar 10;69(5):877-84.
Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.Edgren H,et al. Genome Biol. 2011 Jan 19;12(1):R6.
Genome-wide association mapping to candidate polymorphism resolution in the unsequenced barley genome.Cockram J,et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21611-6. Epub 2010 Nov 29.
MHC class II transactivator CIITA is a recurrent gene fusion partner in lymphoid cancers.Steidl C, et al.Nature. 2011 Mar 17;471(7338):377-81. Epub 2011 Mar 2.
Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.Navin N,et al.Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4. Epub 2011 Mar 13.
備注: 是目前市場上最主流的測序儀器，demo case眾多；另外，The additional benefit is experimental flexibility- applications that require different read lengths can be run on each flowcell – an example is that a whole genome sequencing and de novo sequencing study (eg. Of human and microorganism) could be run on one flowcell at 2 x 100bp reads, and the other could be running ChIP-seq and gene expression samples at 1 x 50bp read length. Each flowcell is controlled independently; hence, a run can be started/stopped independent of the other.