九大測序平臺對比（二）

2.454

企業: Roche

推出時間: 2005年

主流型號: Genome Sequencer FLX Titanium（2008年推出）

樣品要求: 5 μg of DNA，濃度≥300 ng/μL

測序原理：焦磷酸測序

在測序時，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。

文庫制備：Fragment(300-800 bp), Mate-pair

模板制備：微乳液PCR

讀長：400bp

測序通量：0.4-0.6 Gb/run

時間/run：10 hours

堿基精確度：Q20讀長為400個堿基

變異檢測能力(DNA重測序方面：SNP, Indel, SV, CNV

成本：儀器$500,000/臺，測序$5,600 per whole plate

數據格式：Raw data：SFF格式

分析軟件：GS De Novo Assembler軟件；GS Reference Mapper軟件；GS Amplicon Variant Analyzer軟件

優點：突出優勢是讀長長，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。速度快，一個測序反應耗時10個小時，獲得4-6億個堿基對。

缺點：無法準確測量同聚物的長度，所以檢測插入缺失突變的誤差率高；通量小且費用高。

經典案例：1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.

(更多詳見https://www.roche-applied-scienc ... ng/genome/index.jsp)

備注：特別適合從頭拼接和宏基因組學應用，多用于新的細菌基因組。對重測序來說太貴，不適合

3.Solid

企業: Life Technology(2008年，ABI與Invitrogen合并為Life Technology公司)

推出時間: 2007年

主流型號: Solid?4.0（2010年推出）

樣品要求:

? Fragment文庫10 ng-5 μg

?Paired-end文庫10 ng-5 μg

?Mate-paired文庫5 μg-20 μg

測序原理: 邊連接邊測序

測序引物與接頭可以互補雜交，其5‘端可與和鄰近序列互補的寡核苷酸相連。八聚體寡核苷酸可競爭性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標記位點）。當其標記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標記，進行下一輪反應，以此依次循環。在第一輪反應中，可以得到確定的堿基位點為：4、5、9、10、14、15位堿基等。重復該反應過程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個堿基的引物進行反應，可以確定的堿基位點包括：3、4、8、9、13、14等，如此往復，直至偏移至引物的第一個堿基（即待測序列0位點堿基）。由于該位點堿基已知，可通過讀取的熒光顏色得知位點1的堿基類型，然后，又以位點1堿基熒光顏色推知位點2的堿基類型，依此類推，直至整個序列讀序完成。

文庫制備:

? Mate-paired 文庫 (插入片段 600 bp to 10 Kb)

? Paired-end 文庫

? Fragment 文庫

模板制備: 微乳液PCR

讀長: 2*50 bp

測序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day

時間/run: 7~12 days

堿基精確度: 原始堿基數據的準確度大于99.94%，而在15X覆蓋深度時的準確度可以達到99.999%

變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP, Indel, SV, CNV

成本: 儀器$495,000/臺，測序$6000/100Gb

數據格式: Raw data: *csfasta和*quel；比對輸出格式：BAM/SAM。

分析軟件: 分析軟件：Bioscope,比對后格式有很多第三方軟件支持

優點: 高準確性，每個DNA堿基檢測2次，增加了序列讀取的準確性

缺點: 運行時間長，檢測堿基替換突變的誤差率高

經典案例: SOLiD測序技術僅在DNA應用發表的文章共60篇，包括發表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中de nove sequencing文章3篇，targeted resequencing文章26篇，whole genome resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表觀等文章應用也同樣廣泛。

備注: 行業領先的準確性實現了重要的生物變異檢測，適合全基因組重測序、定向重測序和全轉錄組分析等應用。