九大測序平臺對比（五）

7.The PacBio RS system

企業: Pacific Biosciences

推出時間: 2010年2月開始早期試用

主流型號: PacBio RS

樣品要求: 1kb以下500ng，純化的基因組 DNA, BACs, cDNA 文庫 或PCR 產物

測序原理: 邊合成邊測序，single molecule, real-time, or SMRT?, technology

這項技術的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零波段邊界)。測序的平臺上有幾萬個小井，單個DNA聚合酶和要測序的DNA鏈固定在每一個小井里。帶有熒光標記的脫氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每個小井里。每一種脫氧核苷酸在激化后分別能放出不同波長的熒光。小井的底部開了一個非常小的孔，小到比探測激光的單個波長還要短。根據我們的常識，這個孔太小了，激光無法從井的底部穿過去，從而無法激發脫氧核苷酸上的熒光物質。應此，底部的顯微鏡檢測到的是一片黑暗。但是我們知道光線是一種波，它會衍射，激光雖然不能完全穿過小孔照亮整個小井，但它能透過小孔而勉強照亮小孔附近很小的一個區域。而DNA聚合酶正好被固定在這個小區域。當有單個脫氧核苷酸加載在DNA聚合酶上形成新的化學鍵時，這個脫氧核苷酸上的熒光物質被激活而發光，從而被顯微鏡觀測到。這種特定顏色的熒光只持續一小段時間，應為這個堿基在DNA鏈上合成之后，它的熒光基團就會被剪切掉，從而繼續下一個堿基的合成。當DNA鏈合成結束之時也是DNA鏈測序完成之時。但DNA聚合酶的活性會在激光照射下逐漸減弱，不能無限長度的進行合成反應，因此DNA鏈的測序長度也是有限的。

文庫制備: Fragment, Mate-pair (250bp-6kb)

模板制備: SMRTbell? library, 無需常規擴增，1kb以下的文庫只需要500ng樣品

讀長: 1000bp

測序通量: 高靈活性的測序通量

時間/run: 模板制備到 primary basecall analysis只需不到一天,一般只需要不到4個小時.

堿基精確度: 準確率社會評價不高，2011年1月發表的NEJM雜志（關于海地霍亂的測序）在其supplementary提到它的單堿基準確率只有81-83%。

關于其準確率的社會評價不好，有網站稱其準確度很差，單次測序平均錯誤率15%，循環測序后降至8%

變異檢測能力(DNA重測序方面): SNP、Indel、SV、CNV，可以直接進行甲基化等修飾測序，方便表觀研究

成本: $700,000 per machine，$99 per SMRTTMCell, each patterned with 15,000ZMW, each ZMW contain a single DNA polymerase.

數據格式: bas.h5 – Base File and Filtered Bases File - Documentation

cmp.h5 – Reference Mapped File and Consensus File - Documentation

分析軟件: mapping：BLASR (Basic Linear Alignment with Successive Refinement)；組裝：ALLORA (A Long Read Assembler)；SNP 和Indel ： RCCS (Reference Circular Consensus Sequencing) 客戶端軟件：SMRT Portal；提供：experiment specific, data-rich reports in industry-standard output formats containing both primary and secondary analysis data。可以使用第三方軟件。

優點: 讀長長；無需PCR擴增，也避免了由此帶來的bias；需要的樣品量很少；樣品制備時間花費少；用RS系統可以遠程快速獲取數據和選擇測序參數；通量靈活；時間快

缺點: 準確性低，需要循環測序，

經典案例: The Origin of the Haitian Cholera Outbreak StrainChen-Shan Chin,et al.N Engl J Med 2011; 364:33-42January 6, 2011.

Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.John Eid, et al.Science 2 January 2009:

Vol. 323 no. 5910 pp. 133-138

DOI: 10.1126/science.1162986

備注: 1.在樣品制備好后，有一個run design的步驟，可以在客戶電腦上用RS remote 軟件來自主選擇運行方式和后續的個性化分析服務，以及第一時間接受測序數據2.截止2011年5月份已正式發售了多臺RS測序儀，其中包括美國國家生化防衛分析與對策中心（NBACC）和冷泉港實驗室。