鑒于其重要的應用價值,因此測定LP 活性尤為重要。目前,國內外有關LP 檢測方法的研究較多,大多是基于顏色反應,利用酶促反應原理,借助分光光度計測定酶活大小 。
苯胺類檢測LP 活性
以苯胺類為底物測定過氧化物酶活性,其原理為在過氧化物酶存在時,H2O2 可使苯胺發生氧化聚合反應,產物為棕褐色物質。該物質于415 nm 波長下有最大光吸收,因此利用分光光度法測定反應液的吸光度,以吸光度的變化速率來表征過氧化物酶活力。
愈創木酚法檢測乳過氧化物酶
愈創木酚檢測方法的原理,在LP 催化作用下,過氧化氫氧化愈創木酚,產物為醌類化合物,此化合物可進一步縮合或與其他分子縮合,生成紅棕色的4 -鄰甲氧基苯酚。利用愈創木酚檢測方法測定LP 時要求嚴格控制時間,檢測過程中用酸終止酶促反應,導致試驗結果明顯偏低。
ABTS 法檢測乳過氧化物酶
ABTS 主要用來測量和表征抗氧化劑抗氧化能力,是近些年興起的一種相對簡便的用于體外測定物質總抗氧化能力的方法。最初由Marklund 提出,用含有蛋白質的血紅素過氧化物酶與ABTS 反應生成ABTS+,用于測定樣品中血紅蛋白的含量,目前已廣泛應用于包括血清類的生物樣品、果蔬類和一些純物質抗氧化能力的測定。利用ABTS 法檢測LP的原理如下:在LP的催化作用下,過氧化氫可將無色的還原型ABTS 氧化,生成的氧化型ABTS 為綠色物質,該綠色物質于416 nm 波長附近有最大光吸收。根據顏色的深淺,借助于可見分光光度計,測定反應的吸光度,進而換算待測樣的酶活或酶濃度。
TMB 法檢測乳過氧化物酶
TMB 因其安全性和較高的敏感性,正逐步取代有致癌性的ABTS 顯色劑用于LP 的檢測中。TMB檢測法的原理是在過氧化物酶存在條件下,TMB 能被過氧化氫氧化生成明亮的藍色物質,已知該有色物質于波長655 nm 下有最大吸收峰。根據顏色的深淺,借助分光光度計,測定反應的吸光度,進而換算待測樣的酶活或酶濃度。
免疫學方法
酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 即將抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。ELISA 方法是近30 年來發展起來的綜合性酶免疫化學分析方法,采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產生顏色反應,用于定量測定抗原或者抗體。使用該測定方法有3 種必要的試劑:固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)、酶標記的抗原或抗體(標記物)、酶作用的底物(顯色劑)。