二抗孵育時間為1至2小時。
參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫在搖床上緩慢搖動孵育1至2小時。回收二抗。二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當的比例。
一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存。
二抗孵育注意事項
抗體保存注意事項，收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存；對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在零下二十度；分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。
復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在四十攝氏度，避免再凍起來；絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。大部分抗體收到后四十攝氏度短暫保存1至2周對抗體活性是沒有影響的。長期保存，加入疊氮納，防止細菌污染。