實驗方法原理
亞硝基胍(NG、NTG)是一種廣泛使用的強誘變劑。它主要在DNA鏈的復制區引起GC→AT的轉換,即使在致死率很低的條件下也能對微生物產生高頻率的突變。本實驗利用亞硝基胍對谷氨酸棒桿菌進行誘變后,通過點種法檢測出營養缺陷型,再經生長譜法進行鑒定,獲取營養缺陷型菌株,并確定其營養缺陷的具體物質。
實驗材料 菌株 : 谷氨酸棒桿菌 ( Corynebacterium glutam icum) T-13∶bio -
試劑、試劑盒 CB培養液CB固體培養基CB斜面MM培養基MM斜面檸檬酸緩沖液(pH5.5)磷酸緩沖液(pH7.0)生理鹽水亞硝基胍混合氨基酸混合維生素(用10種等量的維生素混合而成)堿基混合物(用6種等量的堿基混合而成)。
儀器、耗材 恒溫培養箱 振蕩器 三角瓶 試管 吸管 影印板 牙簽
實驗步驟
(一)誘變處理
1.菌懸液的制備
挑取少許斜面菌種接入5mlCB培養液中,置30℃振蕩(200r/min)培養8h,取0.5ml培養物轉入另一5ml CB培養液中,繼續振蕩培養過夜。取過夜培養物經4000r/min離心8min,棄去上清液;先加入1ml的檸檬酸緩沖液(pH5.5)于離心管中攪勻沉淀物,再加4ml同樣的緩沖液制成菌懸液;經4000r/min離心8min,如此反復將菌體洗滌兩次,最后加入5ml上述緩沖液制成菌懸液(約108個/ml)。
2.亞硝基胍誘變處理
取2支無菌小試管分別加入2ml菌懸液,置37℃水浴預熱。其中一支小心地加入50μl NTG溶液(原始濃度為2mg/ml),混合均勻,將兩支試管同時置37℃水浴保溫30min。取出兩支保溫的試管經4000r/min離心8min,小心棄去上清液(上清液放在盛有1mol/L NaOH溶液的器皿中,切勿將含有NTG的上清液滴在皮膚或衣物上),分別加入5ml磷酸緩沖液(pH7.0)制成菌懸浮液,再離心8min,如此反復洗滌兩次,最后加入2ml磷酸緩沖液制成菌懸液。分別取2種菌懸液各0.5ml按10倍稀釋法將菌懸液稀釋至10-6,分別取10-4,10-5和10-6稀釋液涂布在CB平板上,每稀釋度涂布9皿;同樣取未經誘變處理的菌液稀釋后每稀釋度涂布3皿作為對照;置30℃培養2d。統計平板上的CFU數,計算殺菌率。平板上的菌落將用于檢出的菌落。
(二)營養缺陷型的檢出
1.點種法
取基本培養基(MM)和完全培養基(CB)平板,用記號筆在平板底部做相對應的標記(即一套MM平板和一套CB平板相對應)。將事先已編號的格子紙(見圖23-1)分別放在對應平板的底部。用無菌牙簽小心地在待測菌落表面蘸取少許菌苔,分別點在MM和CB平板對應位置上(先點MM平板,后點CB平板。盡可能多挑選菌落),置30℃培養2d。
2.影印法
取MM、CB平板各1皿,在平板底部畫箭頭作為方向標記。選擇菌落分散的平板作為母平板,同樣標記方向,無菌影印板上也做方向標記。按標記的方向將母平板倒放在影印板的絨布上,然后取出影印板,按同樣的方法將MM平板倒放在影印板上,取下MM平板,同樣將影印板上的細胞印在CB平板上。成對的影印平板置30℃培養2d。
3.夾層法
取無菌培養皿3皿,各倒一薄層(約5ml)MM培養基,凝固后加入0.1ml經誘變處理的10-5稀釋菌液,再倒入約5ml的MM培養基(熔化后稍冷,不燙手即可,溫度約45℃),搖勻,待凝固后再加上一層約5ml的MM培養基,凝固后置30℃培養2d。在上述平板底部將長出的菌落做上記號,統計其菌落數,再加上一層約5ml的半固體CB培養基,置30℃培養2d。
上述三種方法中,在MM培養基上不能生長,而在CB平板上相對應位置生長的菌落需要進一步復證是否為真正的營養缺陷型。將這些可能為缺陷型的菌落編號,分別對應接種在MM斜面和CB斜面上,置30℃培養2d。將在MM斜面上不長,而在CB斜面上生長的菌種保存,供進一步鑒定用。
(三)營養缺陷型的鑒定
1.初步測定
輕輕挑取一環待測菌種于0.5ml生理鹽水中,振蕩制成菌懸液。取0.1ml上述菌懸液均勻涂布在MM平板上。待干后在平板底部按圖23-2分成三個區域,并分別標上A、V和B。用無菌牙簽分別挑取營養混合物輕輕放在相應的區域中央(不過于偏向平板中央或邊緣),置30℃培養2d后根據三個區域的生長情況確定其所屬營養缺陷的類別。
2.準確鑒定
按上述方法將初步測定的缺陷型菌株制成菌懸液,涂布在MM平板上。在平板底部劃分區域(劃分的區域數和需添加的生長因素編組數相同)。按區域對應地加入少許編組營養物質混合物,置30℃培養2d后觀察結果。
1.將接觸過亞硝基胍的所有器具放在通風處,用1mol/L NaOH溶液浸泡,使殘余的亞硝基胍分解破壞,然后用水清洗干凈。
2.影印和鑒定缺陷型菌株時,MM和CB培養基上的生長情況要及時對照觀察,以免影響結果判斷的準確性。
3.初步鑒定和準確鑒定時菌液細胞密度可略高,能使待測菌均勻地分布在培養基表面。