亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測甲基化

重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，用PCR擴增（引物設計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響）所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最后對PCR產物進行測序，并且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點的甲基化狀態。

DNA

NaOH苯二酚（氫醌）亞硫酸氫鈉石蠟油

離心管恒溫水浴鍋鋁箔紙

1.將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；

2.加5.5ul新鮮配制的3M NaOH； 

3. 42℃水浴30min；

水浴期間配制：

4.10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）

5. 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6.EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。 

7.加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。

8.50℃避光水浴16h。

避免化學品或外源DNA的污染。

甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠對大家有所幫助。

第一部分 基因組DNA的提取。

這一步沒有懸念，完全可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。

此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。

使用兩者的細節：

1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。

驗證提取DNA的純度的方法有二：

1：紫外分光光度計計算OD比值；

2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

我傾向于第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度，并根據Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。

第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經高壓蒸汽滅菌。

1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；

2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期間配制：

4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）

5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。

7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時間上很合適。

這一步細節：

1：基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。

2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術要過關，既要快，又要精確。

3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調制5.0，否則PH不合適會影響后續純化吸收。

4：水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不完全。