實驗概要
1. 掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。
2. 觀察產甲烷菌的形態特征并了解產甲烷菌的生長特性。
實驗原理
1. 產甲烷菌：
厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。產甲烷菌是專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，產甲烷菌的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。
2. 產甲烷菌的發現歷史：
自1901—1903年巴斯德研究所的馬載（Maze）第一次觀察到一種產甲烷菌的微球菌（馬氏甲烷球菌）以來，迄今共發現了五十多種產甲烷菌。1974年Bryant提出產甲烷菌這一名詞，為避免這一類細菌與氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Balch
W.E.等人根據菌株間16SrRNA降解后各寡核苷酸中堿基排列順序間相似性的大小，提出了一個新的系統分類方法，共分為3個目、4個科、7個屬、13個種。
3. 定義、性質及分布：
產甲烷菌（Mathanogens）是一類必須生活在厭氧生境下并伴有甲烷產生的古生菌，其形態和生理、生化特性呈現明顯的多樣性。它生長的氧化還原電位約為-0.33V，最適生長溫度為35—40度，最適pH為6.0-7.2。例如細胞形態有球狀、短桿狀、長桿狀、螺旋狀和絲狀等；Gram染色反應有陽性、陰性和不定性；生長所需碳源約有10多種，除CO2外，還有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有當產甲烷菌在利用H2作CO2還原劑以產生生物合成所需細胞物質，才能利用CO2作電子受體以產生ATP和CH4。
產甲烷菌廣泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和動物的腸道、昆蟲的腸道、濕樹木、地熱泉水、深海火山口、水田和海洋的沉積物、沼澤等厭氧環境中都有產甲烷菌存在。
4. 產甲烷菌的培養：
在培養產甲烷菌時，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0，O2的濃度與1atm的氧平衡時，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的水中含有1.48×10-55個O2。所以說，要保證產甲烷菌培養時的低電位是很重要的。
產甲烷菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術 因此他是世界上第一個分離純化產甲烷菌的人。
以后這項技術又經歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，并逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優點是：預還原培養基制好后，可隨時取用進行試驗；任何時間觀察或檢查試管內的菌種都不會干擾厭氧條件。
主要試劑
培養基：改良的PRAS無氮培養基
[配方組成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青（還原指示劑）1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養基加入1%Na2S（還原劑）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制劑）各0.1ml]
糖發酵培養基、蛋白胨水培養基、淀粉培養基（液體）；
冰塊 Na2S NaHCO3;
乙醚 吲哚試劑 盧戈氏碘液；
主要設備
高純氮氣 厭氧管 厭氧手套箱 注射器 恒溫培養箱 銅柱除氧系統 定量加樣器 厭氧罐 超聲波破碎儀 酒精燈 冰塊 水浴鍋 記號筆 振蕩器
實驗材料
菌種：
待測樣品
已分離純化的產甲烷菌（Mathanogens）；
實驗步驟
1. 分離與培養
(1) 銅柱系統除氧
銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變為黑色。當向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發生器產生。
(2) 預還原培養基及稀釋液的制備
在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預還原培養基及稀釋液時，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。
(3) 分離
1) 編號
取五支無菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
2) 稀釋
在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行滾管計數。
3) 滾管分離
a 滾管
將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。
b 分離純化
生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長時間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。
c 劃線分離
將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因為CO2比空氣重，開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管，置34-37度下培養，便可長出菌落。
(4) 鏡檢與計數
1) 鏡檢
挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態。
2) 計數
液體純培養物經系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有產甲烷菌的數量。公式如下：
產甲烷菌數量cfu/g（mL）樣品=A×10ml×X/10×D
A-0.1mL滾管計數的實際平均值；
X- 鏡檢呈現為產甲烷菌的數目；
X/10-菌落中產甲烷菌的概率；
D- 稀釋倍數
2. 菌種的鑒定
(1) 糖發酵試驗
糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）]，當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。
具體實驗步驟：
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③ 24h后觀察各管中液體顏色變化及產氣情況。
(2) 蛋白質分解實驗
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③24h后各管分別進行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。
(3) 淀粉水解實驗
① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
③ 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。
注意事項
1. 注射器在使用前必須經過121℃、20min滅菌。
2. 注意無菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。
3. 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。
4. 樹脂刃天青（resazurin）既是還原劑又是指示劑，它可以把培養基中殘留的溶解氧去除，其氧化還原電位指示敏感范圍為-42mV。有氧時呈紫色或粉紅色，無氧時呈無色（培養基的顏色），它是較為理想的氧化還原電位指示劑和培養嚴格厭氧菌不可缺少的。
5. 培養基中加入的青霉素是用來抑制其它細菌生長的，因為產甲烷菌的細胞壁成分為假肽聚糖，不受青霉素影響。
6. 注射器在使用前必須先用培養基上面的氣體沖洗、填充，然后插入培養基的下層，以保證當培養基移入試管時，就處于無氧氣體層的下面。