親和層析(AffinityChromatography)(1)

親和層析(Affinity Chromatography)是利用生物分子間專一的親和力而進行分離的一種層析技術。人們很早就認識到蛋白質、酶等生物大分子物質能和某些相對應的分子專一而可逆的結合，可以用于對生物分子的分離純化。但由于技術上的限制，主要是沒有合適的固定配體的方法，所以在實驗中沒有廣泛的應用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝膠并偶聯蛋白質技術的出現，解決了配體固定化的問題，使得親和層析技術得到了快速的發展。親和層析是分離純化蛋白質、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應用。同時它也可以用于某些生物大分子結構和功能的研究。
親和層析的基本原理
生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉的抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等等，它們之間都能夠專一而可逆的結合，這種結合力就稱為親和力。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質上的分子稱為配體，配體和基質是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質作為配體，例如分離酶可以選擇其底物類似物或競爭性抑制劑為配體，分離抗體可以選擇抗原作為配體等等。并將配體共價結合在適當的不溶性基質上，如常用的Sepharose－4B 等。將制備的親和吸附劑裝柱平衡，當樣品溶液通過親和層析柱的時候，待分離的生物分子就與配體發生特異性的結合，從而留在固定相上；而其它雜質不能與配體結合，仍在流動相中，并隨洗脫液流出，這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當的洗脫液將其從配體上洗脫下來，就得到了純化的待分離物質。
前面介紹的一些層析方法，如吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等都是利用各種分子間的理化特性的差異，如分子的吸附性質、分子大小、分子的帶電性質等等進行分離。由于很多生物大分子之間的這種差異較小，所以這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物質通常需要多種方法結合使用，這不僅使分離需要較多的操作步驟、較長的時間，而且使待分離物的回收率降低，也會影響待分離物質的活性。親和層析是利用生物分子所具有的特異的生物學性質－親和力來進行分離純化的。由于親和力具有高度的專一性，使得親和層析的分辨率很高，是分離生物大分子的一種理想的層析方法。
親和吸附劑
選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關鍵步驟之一。它包括基質和配體的選擇、基質的活化、配體與基質的偶聯等等。
基質
⑴ 基質的性質
基質構成固定相的骨架，親和層析的基質應該具有以下一些性質：
①具有較好的物理化學穩定性。在與配體偶聯、層析過程中配體與待分離物結合、以及洗脫時的pH、離子強度等條件下，基質的性質都沒有明顯的改變。
②能夠和配體穩定的結合。親和層析的基質應具有較多的化學活性基團，通過一定的化學處理能夠與配體穩定的共價結合，并且結合后不改變基質和配體的基本性質。

③基質的結構應是均勻的多孔網狀結構，以使被分離的生物分子能夠均勻、穩定的通透，并充分與配體結合。基質的孔徑過小會增加基質的排阻效應，使被分離物與配體結合的機率下降，降低親和層析的吸附容量。所以一般來說，多選擇較大孔徑的基質，以使待分離物有充分的空間與配體結合。
④基質本身與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結合。基質應具有較好的親水性，以使生物分子易于靠近并與配體作用。
一般纖維素以及交聯葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質，其中以瓊脂糖凝膠應用最為廣泛。纖維素價格低，可利用的活性基團較多，但它對蛋白質等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用，另外它的穩定性和均一性也較差。交聯葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學穩定性較好，但它們的孔徑相對比較小，而且孔徑的穩定性不好，可能

會在與配體偶聯時有較大的降低，不利待分離物與配體充分結合，只有大孔徑型號凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點是機械強度好，化學穩定性好。但它可利用的活性基團較少，對蛋白質等生物分子也有較強的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個條件，它具有非特異性吸附低、穩定性好、孔徑均勻適當、宜于活化等優點，因此得到了廣泛的應用，如Pharmacia 公司的Sepharose－4B、6B 是目前應用較多的基質