親和層析技術

親和層析

    （一）原理

    親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應的抗體（或抗原）發生特異性結合，而這種結合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應抗體（或抗原）選擇性地結合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質分開，達到分離提純的目的。

    此法具有高效、快速、簡便等優點。

   （二）載體的基本要求和選擇

理想的載體應具有下列基本條件：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質，非特異性吸附少；③具有相當量的化學基團可供活化；④理化性質穩定；⑤機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好為多孔的網狀結構，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

    可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強。聚丙稀酰胺凝膠是目前的首選優良載體。

    瓊脂糖凝膠的優點是親水性強，理化性質穩定，不受細菌和酶的作用，具有疏松的網狀結構，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時，對蛋白質幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質穩定，能經受層析的各種條件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h~3h及蛋白質變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質改變，故易于再生和反復使用。

    瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時分別稱為2B、4B、6B。因為Sepharose 4B的結構比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應用最廣。

    （三）試劑與配制

    1．Sepharose 4B

    2．CNBr（劇毒）

    3．抗原或抗體

    4．1Mol/L NaHCO₃  取NaHCO₃ 84.01g加水至1 000ml。

    5．0.1Mol/L NaHCO₃

    6．2Mol/L NaOH

    7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

       0.2Mol/L Na₂HPO₄   38.0ml

       0.2Mol/L Na₂HPO₄  162.0ml

                NaCl      32.76g

    加水至4 000ml。

    8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液  甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

    9．7Mol/L尿素

    10．0.2Mol/L NaHCO₃,（含0.1Mol/L NaCI）

       1Mol/L NaHCO₃  100.00ml

              NaCl     2.93g

       加水至500.00ml。

    （四）實驗方法

    1．瓊脂糖活化

    ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃液洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。

    ⑵ 在通風櫥內稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應10min。在1min~2min迅速調整pH為8.0～11.0維持10min。

    ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃抽洗。

2．偶聯蛋白  20ml 4B液體相當于一半的固相載體。

⑴ 事先將需偶聯的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO₃液中透析數小時(一般偶聯量為10~30mg/g載體)。

⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內，從抽洗到偶聯），4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結合。

3．裝柱

    ⑴ 選柱：不宜過大，一般以1.5×375px的層析柱可裝偶聯蛋白的瓊脂糖約30ml。

    ⑵ 裝柱：將已與蛋白偶聯的瓊脂糖裝入層析柱內，擰緊下口夾，讓其下沉，數分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。

    ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO₃（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD₂₈₀＜0.02為止。

收集全部的洗脫液，測得的OD₂₈₀值×洗脫液的總ml數即為未偶聯蛋白的含量，由此可計算偶聯率。

4．吸附與解吸附

    ⑴按床體積1/10加樣，濃度為1％～2%，緩慢加入待純化的抗體（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD₂₈₀＜0.02為止。

    ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO₃中和，以免蛋白變性。

5．以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續使用。保存可加入0.02%Na N₃于4℃保存。防止冷凍和干裂。

6．結果判定

    ⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進行純度鑒定。

⑵ 將純度好的各管洗脫液合并，以生理鹽水透析，然后濃縮或凍干保存。