本實驗采用豬胰蛋白酶的天然抑制劑—雞卵類粘蛋白作為配基．從豬胰臟的粗提液中分離純化胰蛋白酶。雞卵類粘蛋白是一種專一性很強的胰蛋白酶的抑制劑，對豬和牛的膠蛋白酶有很強的抑制作用。而對胰凝乳蛋白酶無抑制作用。在pH7.6~8.0的范圍內，豬或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在雞卵類粘蛋白上，在
PH2.5~3.0的范圍內，能從雞卵類粘蛋白上被洗脫下來。因此，采用雞卵類粘蛋白作為配基合成親和吸附劑，可以從豬胰臟的粗提液中，通過親和層析直接獲得純度很高的豬胰蛋白酶。比活力可以達1.5~2.0×104BAEE
單位／mg 酶蛋白，相當5次重結晶的胰蛋白酶，純化效率可提高10－20倍以上。
三、儀器、原料和試劑
器材：
紫外分光光度計、核酸蛋白質檢測儀、高速組織搗碎機、恒溫水浴搖床、L 層析柱(10mm×100mm)、G—3玻璃燒結漏斗、酸度計、抽濾瓶。
原料
新鮮豬胰臟
試劑
1. 環氧氯丙烷，1，4—二氧六環，乙烯，乙腈，溴化氰
2. 5mol/L 硫酸；
3. 5.0mol/L 氫氯化鈉
4. 0.2mol/LpH9.5碳酸鈉緩沖液。
5. 親和柱平衡液：0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣－0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 緩沖液；
6. 親和柱洗脫液：0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液；
7. pH2.5~3.0乙酸酸化水。
8. Sepharose 4B ，雞卵類枯蛋白，純胰蛋白酶。
四、操作步驟
(一) 載體—SePharose4B 的活化
1．環氧氯丙烷活化法：
取適量的sepharose 4B，于G—3玻璃燒結漏斗(簡稱G—3漏斗)上抽去保護液。稱10g(濕重)Sepharose
4B，用100mL0.5mol/L 氯化鈉溶液淋洗，除去56Pha rose 4S 凝膠內的保護劑，用蒸餾水洗凈，轉移到100mL
的錐形瓶內。然后加入6.5mL 2.0moL／L 氫氧比鈉溶液、1.5mL 環氧氯丙烷、15mL
56％1，4二氧六環，于45℃的恒溫水浴搖床內振蕩活化2小時。然后將活化的凝膠轉移到G3漏斗內抽干，用蒸餾水洗至pH8.0左右，再用20mL
0.1mol/L，pH9.5碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯。
2．溴化氰活化法：
稱取10g Sepharose 4B(濕重)，凝膠處理方法與1相同，把SePharose 4B 凝膠轉移到一個100mL
的燒杯中(以下操作步驟必須在通風櫥內進行)。加入15mL
0.2mol/LpH10.0的碳酸鈉緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用電磁攪拌器慢慢攪拌。戴上膠皮手套，小心稱取3g 溴化氰，加入3mL
乙腈將溴化氰溶解。
取一支滴管向燒杯內滴加溴化氰使它與Sepharose 4B 反應，同時取另一支滴管向燒杯內滴加6mol/L 的氫氧化鈉．使反應體系的pH
值保持在pH10.0左右(在酸度計上校正)，待溴化氰加完以后繼續攪拌，反應5分鐘。此時反應體系的pH
值不再下降，仍維持在pH10.0左右，停止反應。迅速轉移到G3漏斗內抽濾，抽濾瓶內應預先加入一定量的固體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應的溴化氰。用
200mL 預冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸鈉緩沖液中，處理完成后立即偶聯。
3．配基—雞卵類粘蛋白的偶聯：
將已經活化處理好的Sepharose 4B 轉移到一個50mL 的錐形瓶內。然后取I0mL0.1mol/L，pH
9.5的碳酸鈉緩沖液將約150mg 的雞卵類粘蛋白溶解，取出0.1mL
蛋白溶液稀釋30倍，在紫外分光光度儀上測定A280。根據消光系數A＝4.13計算出偶聯前的蛋白含量。再將9.9mL
蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B 的三角瓶內，混勻，在40－45℃的恒溫水浴搖床內振蕩偶聯20－24小時左右，終止偶聯。
將凝膠轉移到G3漏斗內，用100mL 0.5mol/L
的氯化鈉溶液抽濁、淋洗，以除去未被偶聯的雞卵類粘蛋白。取一個干凈的抽濾瓶收集濾波，測定濾液A280，計算出末被偶聯蛋白的量，然后用100mL的蒸餾水洗，用50mL
0.1mol/L 甲酸－0.5mol/L
氯化鉀，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸餾水洗至約pH6.5即可。將凝膠轉移至50mL小燒杯內，用30mL
0.5mol/L氯化鉀—0.05mol/L氯化鈣0.1mol/L、pH7.8Tris—HCL 緩沖液浸泡20分鐘。脫氣后裝柱或置4℃冰箱保存。
(二) 胰蛋白酶粗操液的制備
取50g
豬新鮮胰臟(除去脂肪和結締組織)剪碎置于高速組織搗碎機內，加入200mL預冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，勻漿。于10℃提取4小時以上，4層紗布過濾，收集濾液并用5mol/L
的氫氧化鈉調至PH8.0，加入終濃度為0.1mol/L 氯化鈣及1~2mg
胰蛋白酶晶種，置4℃激活12~16小時或在室溫(25℃左右)激活2~4小時。待胰蛋白酪比活達到1000~1500 BAEE 單位／mg
以后，用6mol/L 硫酸調至pH3.0停止激活。
放置4℃冰箱內備用。測定胰蛋白酶活性。
(三)親和層析純化胰蛋白酶
取一支層析柱(10mm×100mm)，裝入少量親和柱平衡液(0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣0.1mol/L，pH7.8
Tris—HCl
緩沖液)，將親和吸附劑一次裝入柱內，待親和吸附劑自然沉降至約1/2總體積后，調節合適的流速。用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質檢測儀檢測流出液．待基線達到穩定后即可。
取一定體積的蛋白酶粗提液(30－50mL，視酶液的蛋白濃度及比活而定)調至pH8.0．用濾紙過濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質檢測儀檢測流出液，待基線達到穩定后改用親和柱洗脫液(0.1mol/L
甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液)洗脫。收集洗脫峰2，測定酶蛋白含量及活性，
層析圖譜，如圖3—9。
圖3—9 親和層析純化胰蛋白酶洗脫曲線
平衡液：0.5mol/L 氯化鉀，0.05mol/L 氯化鈣，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 緩沖液。
洗脫液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液。
(四) 胰蛋白酶的保存
經親和層析分離得到的胰蛋白酶，一般是比較純的酶，但是酶蛋白的濃度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的無機鹽，然后冰凍干燥成粉末，長期保存。也可將酶溶液放在－20℃的冰箱冰凍保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存兩年左右。
(五)結果處理