親和色譜法一般采用柱層析法,要達到好的分離效果,必需選擇好操作條件。
①吸附 親和柱所用的平衡緩沖液的組成、pH值和離子強度都應選擇最有利于配基與生物大分子形成復合物。吸附時,一般在中性條件下,上柱樣品液應和親和柱平衡緩沖液一樣,上柱前樣品應對平衡緩沖液進行充分透析,這有利于絡合物的形成。親和吸附常在4℃下進行,以防止生物大分子因受熱變性而失活。上柱流速盡可能緩慢,流速控制在1.5mL/min。流出液需及時檢測,以判斷親和吸附效率。
②洗滌 樣品上柱后,用大量平衡緩沖液連續洗去無親和力的雜蛋白,層析色譜上出現第一個蛋白峰和其他雜質峰。除了用平衡緩沖液,經常還用各種不同的緩沖液或有機溶劑洗滌,這樣可以進一步除去非專一性吸附的雜質,在柱上只保留下專一性的親和物。
③洗脫 洗脫所選取的條件應該能減弱親和對象與吸附劑之間的相互作用,使復合物完全解離。由于親和層析中親和對象差異很大,洗脫劑很難統一標準。如果親和雙方吸附能力很強,大量的洗脫液往往只能獲得平坦的親和物洗脫峰。此時往往要改變洗脫緩沖液的 pH 值和離子強度,但這種改變不能使親和物失去活性,大多數用0.1mol/L 乙酸或0.01mol/L 鹽酸,有時也可用pH值為10左右的0.1mol/L NaOH溶液洗脫。
④再生 當洗脫結束后,需要用大量洗脫劑徹底洗滌親和柱,然后再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡,親和柱上可以再次加入試樣,反復進行親和層析。暫不用的親和柱可存放在防菌污染的冰箱或冷室(低于4℃)中,以備下次再用。