與小分子藥物不同，大多數基因治療的分子無法通過自由擴散越過生理屏障進入細胞內部，且面臨在血液循環中被降解的問題，因此，遞送問題一直以來都是困擾基因治療臨床應用的主要障礙。經過多年的發展，科學家已發展出包括病毒載體、非病毒載體、細胞遞送等多種用于人體基因治療的遞送途徑。
在早期的研究中，科研人員經常使用直接遞送的方式，外加下肢靜脈加壓、電穿孔等手段在小鼠等動物模型上開展基因治療的實驗，但這些嘗試僅限于驗證基因治療的原理，很難真正應用在人體中。目前只有反義寡核苷酸類基因療法仍多使用直接遞送（注射），這是因為與其他基因治療相比，反義寡核苷酸分子量相對較低，且經過化學修飾后較不易被血液中的核酸酶降解，進入血液循環后可以廣泛分布于各組織中。
病毒感染細胞的過程即是一個將自身攜帶的遺傳物質運載入宿主細胞的過程，因此病毒是天然的基因載體。在基因治療相關的研究中，使用較多的有逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒等。
逆轉錄病毒（Retrovirus）是一種以RNA為遺傳物質的病毒，當病毒感染細胞后，RNA經逆轉錄酶合成雙鏈DNA，雙鏈DNA可以被整合到宿主細胞自身的基因組中，并隨宿主細胞分裂傳遞給子代細胞。使用逆轉錄病毒做為基因載體可以高效轉染分裂旺盛的細胞，但其轉染分裂靜止的細胞能力較差。慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒科下屬的一種病毒，它可以轉染分裂靜止的細胞。由于逆轉錄病毒和慢病毒具備隨機的整合基因到宿主細胞中的能力，使用這一類病毒作為基因載體可產生永久性的基因改變。另外，如果基因在宿主細胞中插入的位置不適當，則有可能造成癌癥等嚴重后果。例如，一項使用逆轉錄病毒載體治療先天性免疫缺陷癥的臨床試驗，在幾年后導致患者得上了白血病。
腺病毒載體（Adenovirus）是另一種常見的病毒載體。相比于逆轉錄病毒載體，腺病毒載體將基因整合到宿主細胞的能力很弱，因此致癌致突變風險較低。腺病毒在分裂旺盛和分裂靜止的細胞中均可復制，應用范圍非常廣泛。另外腺病毒載體包裝容量大，可以用于轉染較大的基因片段。但腺病毒載體免疫原性較高，較易發生過敏等不良反應。第一例基因治療導致的死亡病例即是由于腺病毒載體造成的嚴重過敏反應所致。
腺相關病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）是一種單鏈DNA病毒，該病毒無法自我復制，但可以轉染分裂旺盛或分裂靜止的細胞，并將基因組整合至人19號染色體的一段固定區域中。由于該區域固定且功能已知，腺相關病毒致癌風險較低。與腺病毒相比，腺相關病毒的免疫原性也大大減弱，較少出現不良反應。然而，腺相關病毒包裝容量較小，且生產較為復雜，這一定程度上限制了它的廣泛應用。
單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus, HSV）是一類雙鏈DNA病毒，由于其對神經細胞具有天然的親嗜性，被用于神經系統的基因治療中。HSV載體具有包裝容量大、能感染靜止期細胞、不整合入宿主細胞基因組等一系列優點。然而，HSV對大多數細胞毒性較大，轉染后表達時間較短，因此HSV較少用于其他基因治療中。
由于病毒載體存在著諸如易整合入宿主細胞基因組、免疫原性、毒性等問題，近年來，研究人員嘗試用一些人工合成的化學物質模擬病毒包裝DNA/RNA的過程，以作為取代病毒載體的非病毒基因載體。非病毒基因載體尺寸大多在10到100 nm左右，進入血液循環后，它可利用毛細血管上的窗口被動靶向至特定器官或組織（見“高滲透長滯留效應”），然后借助胞吞/胞飲作用進入細胞內部，利用材料本身的特性誘導溶酶體破裂，最終將攜帶的DNA/RNA釋放到細胞中。
非病毒基因載體進入細胞的過程
非病毒基因載體按化學成分可大致分為脂質體、有機高分子聚合物和無機納米材料這幾類。脂質體（Liposome）是最早被用于基因治療研究的非病毒載體，它是一種由磷脂分子（多為陽離子磷脂）組成的小球，內部包裹需要遞送的DNA/RNA。由于和細胞膜成分接近，脂質體可以與細胞膜發生融合，并釋放需要遞送的材料。第一種獲得FDA批準的siRNA藥物Patisiran即是使用脂質納米顆粒遞送的。
有機高分子聚合物（主要是陽離子聚合物）亦可以通過靜電相互作用壓縮DNA/RNA并遞送至細胞中。相比于脂質體，高分子聚合物在環境中更穩定，結構也更豐富多樣。另外，還可以通過化學反應在高分子材料上引入可以靶向至特定組織或器官的分子，也可以同時將小分子藥物和基因遞送至細胞內以實現協同作用。不過，陽離子聚合物常常存在轉染效率和毒性無法兼容的問題，加之許多聚合物在體內降解困難，很多聚合物材料的毒性（尤其是累積毒性）并未完全被掌握，截至2019年底，尚未有使用有機高分子聚合物載體的基因治療藥物獲得FDA批準。
無機納米材料是另一類探索中的非病毒基因載體。相比于有機高分子聚合物，無機納米材料的形貌較為容易控制，因此經常作為模型用來研究不同尺寸或形貌的載體對遞送效率的影響。但無機納米材料亦存在體內降解困難等瓶頸，目前大多數無機納米載體仍處于實驗室階段。
一種可以繞開遞送過程中生理屏障的辦法是在體外轉染特定的細胞，然后再將已轉染的細胞輸入患者體內。這種思路非常適合血液系統疾病的基因治療。由于體外轉染遠比體內轉染簡單高效，用于體外基因轉染的工具也可以有更多選項，例如CRISPR等新一代基因編輯工具。通過細胞遞送的另一個優勢是可以更好地監測基因轉染的效率和準確性，因為轉染后的細胞可以使用流式細胞儀、RT-PCR等手段完成質量控制后再輸入人體內。
目前臨床上獲得批準的通過細胞遞送的基因治療主要包括嵌合抗原受體T細胞（Chimeric antigen receptor T cell, CAR-T）療法和造血干細胞基因療法。在CAR-T細胞療法中，首先將識別腫瘤相關抗原的序列和負責活化T細胞的胞內信號域序列在體外進行基因重組，然后在體外轉染從患者身上分離的T細胞，經體外擴增后，再將這些可以識別和攻擊腫瘤的工程T細胞輸回患者體內。截至2019年已有兩種CAR-T細胞療法獲得美國FDA批準，用于治療急性淋巴細胞白血病和彌漫性大B細胞淋巴癌（見“添加式基因療法”一節）。與CAR-T細胞類似，在造血干細胞基因療法中，首先從患者身上分離自體造血干細胞，在體外轉入治療性基因后，經體外擴增再輸回患者體內。造血干細胞基因療法本質上相當于在體外糾正自體干細胞的基因缺陷，同時避免了異基因骨髓移植帶來的排異風險。截至2019年底亦有兩種造血干細胞基因治療獲得歐洲EMA批準，分別用于治療ADA-SCID和β-地中海貧血（見“添加式基因療法”一節）。