四、連接方法
半抗原與載體的連接通常可用物理和化學方法進行。物理吸附的載體有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，它們借電荷和微孔吸附半抗原。化學法則是利用某些功能基團把半抗原連接到載體上，這些載體包括血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、銅藍蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚賴氨酸。帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團都有的半抗原，可直接與載體連接。其他不帶有氨基或羧基的半抗原，須加以適當的改造，使其轉變為帶有游離氨基或游離羧基的衍生物，才能與載體連接。
1、有游離氨基或游離羧基以及兩種基團都有的半抗原與載體的連接方法
（1）碳化二亞胺法
碳化二亞胺是一種化學性質非常活躍的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。
此法非常簡便，只要將半抗原與載體蛋白質按一定分子比混合在適當的溶液中，然后加入碳二亞胺，攪拌l～2h，置室溫反應24h，最后透析除去未反應的半抗原，即可得到人工免疫原。
（2）戊二醛法
戍二醛是帶有兩個活性基團雙功能的連結劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接。
（3）混和酸酐法
混合酸酐法又稱為氯甲基異丁酯法，主要用以甾體激素與蛋白質的偶連。以烷基氯甲基為偶連劑，最常用的是氯甲基異丁酯。含有羧基的半抗原與氯甲基異丁酯反應形成混合酸酐，然后在與蛋白質載體上的氨基反應形成肽鍵。
（4）過碘酸氧化法
過碘酸將糖環氧化成雙醛基，再與蛋白質上的氨基偶聯。本法常用于配糖體類藥物與蛋白質的偶聯。
2、帶有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法進行連接
（1）琥珀酸酐法
本法用于帶有羥基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水轉變成琥珀酸。如將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐在無水吡啶中反應，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。
（2）羧甲基羥胺法
帶有酮基的半抗原（如孕酮、睪酮）與O-（羧甲基）羥胺反應，轉變為帶有羧基的半抗原衍生物。
（3）重氮化的對氨基苯甲酸法
本法適于帶有酚基的半抗原（如某些藥物）的改造。先將對氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應，反應產物再作用于帶有酚基的半抗原，從而制得帶有羧基的半抗原衍生物。
（4）一氯醋酸鈉
本法適于帶有酚基半抗原的改造。將帶有酚基的藥物與一氯醋酸鈉反應即可得到帶有羧基的半抗原衍生物。
五、人工免疫原的鑒定
1、抗體的特異性
為獲得特異性強的抗體，并不是半抗原分子上任何功能基團都可以用來與蛋白質聯接，也不是毫無選擇的在半抗原分子上添加可以與載體聯接的功能基團。根據目前的認識，抗體的特異性主要是針對距蛋白質聯接點最遠端的半抗原部分。因此，應將對免疫識別來說最不重要的半抗原部分聯接到蛋白質上。這就是所謂的聯接半抗原的"遠距離"原則。如雌二醇的特殊功能基團有兩個，即C3-OH和C17-OH。如在C6位與蛋白質聯接，形成E2-6-（O-羧甲基）肟，則所得到的抗血清的特異性就好；如在C17位與蛋白質聯接，形成E2-17-半琥珀酸酯，則所得到的抗血清的特異性就差。前者與雌素酮和雌三醇的交叉廣反應率分別為8.0%和0.3%，而后者分別為100%和10%。在實際聯接時可用特殊試劑將特異的功能基團封閉，然后進行偶聯，最后再將封閉劑去掉。
2、半抗原的取代水平
半抗原聯接到載體蛋白上的分子數可影響動物產生抗體的能力。結合半抗原的多少，依半抗原的性質和動物的品種而異。文獻報告每個載體分子只含一個半抗原分子就足以產生半抗原的抗體。一般認為，如以白蛋白為載體，每個白蛋白分子上聯接5～30個半抗原分子較好。從有利于激發對半抗原親和力強的抗體產生細胞，聯接到蛋白質上的半抗原數少一些可能更好。但也有人認為，在免疫后期某些細胞逐漸對半抗原顯示足夠高的親和力，以致能用半抗原-異源載體（即與初始免疫時所用的載體不同）結合物進行觸發，此時免疫應答的大小可能部分的與半抗原的取代數目有關。
半抗原的取代水平可用放射性示蹤法或分光光度法進行測定。
六、放射性示蹤法
在偶聯的反應液中加入一定量的放射性標記半抗原。偶聯反應后經充分透析，測量透析袋中的放射性計數，并計算結合到載體上的放射性百分數。這個百分數指示有同樣百分比的非標記半抗原聯接到載體上。結合抗原中半抗原與蛋白質的分子比可用下列公式計算：
[Pm1 / MW1 ] / [m2 / MW2 ]
其中：P = 放射性百分數；m1 = 半抗原投入量；MW1 = 半抗原的分子量； m2 = 蛋白質的投入量； MW2 = 蛋白質的分子量。
七、分光光度法
根據半抗原的克分子消光系數估算：配制相同濃度的偶聯物和純蛋白溶液，分別在同一波長下讀取OD值，然后按下列步驟計算：
半抗原OD值= 偶聯物OD值－純蛋白OD值
半抗原克分子濃度= 半抗原OD值/ 克分子消光系數
蛋白質濃度= 偶聯物濃度－半抗原濃度
蛋白質克分子濃度= 蛋白質濃度/ 蛋白質的分子量
[半抗原分子/ 蛋白質分子]比值= 半抗原克分子濃度/蛋白質克分子濃度
應用本法計算時應注意兩點：
1、讀取OD值可選用任何波長，但偶聯物與純蛋白的OD值應有盡可能大的差異。即純蛋白的讀數要盡可能的低，以減少誤差。同時該波長處，半抗原的克分子消光系數應為已知，否則須先用半抗原的純品通過實驗求出。
2、由于聯接上了若干分子半抗原，所以偶聯物的分子量實際大于純蛋白質的分子量，故計算的第一步有一定的誤差。但蛋白質的分子量遠大于半抗原，所以如果波長選擇適當，使蛋白質的OD值盡量的小，則這種誤差不會很大。半抗原與載體結合的數目與免疫原性密切相關。一般認為至少要有20個以上的半抗原分子連接到一個載體分子上，才能有效地刺激免疫動物產生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應測定偶聯到載體上的半抗原量。常用吸收光譜分析法測定，如果半抗原基團有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復合抗原和載體之間克分子吸廣度的差別，然后把這個差別與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數相比較，就可以準確地計數所結合的半抗原分子數。亦可應用同位素標記半抗原滲入法，在偶連反應液中加入一定量的放射性標記的半抗原。偶連反應后經充分透析，測量透析袋中的放射性計數，計算結合到載體上的半抗原分子數。