人淋巴細胞染色體標本制作

實驗概要

動物細胞染色體標本的制作方法，認識染色體形態

實驗原理

染色體是細胞遺傳的研究對象，分析認識眼行為對于認識遺傳物質的傳遞、復制、畸變等都有重要的意義。
 

獲得染色體的方法很多，目前對于哺乳動物比較常用的方法是外周血細胞培養法，就是將外周血接種在適當的培養基中進行培育，人類外周血細胞是終未分化細胞，一般沒有分裂能力，但經PHA（植物血球凝集素）或ConA等藥物刺激后，轉變為可分裂的轉化細胞，向培養基中加入適量的秋水仙素，可使細胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細胞。用低滲鹽溶液（一般為0.4%KCl或0.075MKCl）處理，使其中的紅細胞及分裂相細胞的膜破裂并使轉化細胞膨脹，結合離心技術，可將紅細胞碎片及分裂相細胞膜和一部分細胞質除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體標本。

主要試劑

１. 培養基RPMI1640（或Eagles液）、胎牛血清、肝素、PHA、青鏈霉素、5%NaHCO3、2%碘酒、75%酒精、2μg/ml秋水仙素（或10μg/ml秋水仙胺）。

２.低滲液：０.４％KCl，預溫在37oC。

３.固定液：甲醇、冰醋酸，每次在使用前按3：1臨時配制。

４.染  液：2%Giemsa 

主要設備

１.超凈工作臺                        
２.恒溫箱

３.5ml移液管                        
4.鏈霉素瓶

５100 ml血漿瓶                      
6.50 ml量筒

７1 ml，2 ml注射器                  
８.清潔載片（使用前存冰箱中）

9.恒溫水浴（37oC）                  
10.水平離心機

11.尖底離心管（10 ml）                
12.天平

13.試管架，定時鐘                    
14.吸管，橡皮頭

15.相差顯微鏡                        
16.酒精燈

實驗材料

人血 或 豬血

實驗步驟

1.培養基的制備：

在超凈工作臺上，用吸管吸取RPMI1640液10 ml，用1 ml注射器取肝素0.3 ml，PHA0.4 ml，青鏈霉素0.3 ml（各10000單位/ ml），混合均勻后用0.5%的NaHCO3，調整pH為7.0-7.2，然后用5 ml吸管分裝，每小瓶5 ml，用膠布封口。 

　
２.每小瓶接種全血０.３ml左右，在37oC培養箱中培養68-72小時，培養終止前6-7小時加2μg/ml秋水仙素2-3滴，使最終濃度為0.01-0.022μg/ml。

   
３.自培養箱中取出培養小瓶，用吸管將沉于瓶底的細胞沖散均勻，將細胞懸液移進離心管中。

   
４.平衡：將離心管置于已配平的天平上，通過加減離心管中細胞懸液來使天平重新配平。

   
５.將離心管移入離心機的對稱套洞內，蓋上離心機套，打開電源，待速度升到1500rpm時，離心8分鐘。

   
６.用吸管小心移去上清液，留下細胞沉淀和上清液約1 ml，加入低滲液6.5 ml，吸打沉淀，使之混勻，置于37oC水浴10分鐘，同時按甲醇：冰醋酸=3：1比例配固定液20ml，盛于三角瓶中。

   
７.預固定：加1ml新鮮配制的固定液，，打勻細胞，立即以1000rpg離心10分鐘，移去上清夜。

 
８.沿管壁緩慢加入5-6ml新固定液，用吸管輕輕打勻細胞團塊。

   
９.20分鐘后，以1000rpg離心5分鐘，去上清夜。

   
10.重復8-9步2—3次。

 
11.移去固定液，視細胞數量多少加入05-1ml新鮮固定液，將沉淀打成懸液。

 
12.在干凈、濕、冷的玻片上滴2—3滴細胞懸液，在酒精燈下略加烘烤，使其干燥。

 
13.在相差顯微鏡下觀察有無分裂相，如分裂相多，分散較好時，繼續做下列步驟，如不多且分散不好，則停止，如僅是分散不好，可以再固定一次。

 
14將玻片放下染色架上，每片加2ml--3ml ,2%Giemsa染液，染色10分鐘，自來水沖去染液（注意不可先倒掉上染液，否則不易沖掉多余染料），空氣中干燥。

   
15.顯微鏡下觀察。