人源單克隆抗體具有免疫原性低、半衰期長等優勢，成為了體內應用中不可或缺的生物制劑。人類抗體庫為人源單克隆抗體的制備提供了豐富的來源，人B細胞永生化是獲得人類抗體庫的潛在有效方法，可應用于人源單克隆抗體的制備。由于各平臺均有亟待解決的問題，基于人B細胞永生化的抗體制備尚局限在實驗室研究階段，本文以明確現有的人B細胞永生化抗體制備平臺的優劣及其可行性分析，以期為人源單克隆抗體制備技術的進一步發展提供參考。
人源單克隆抗體(Human monoclonal antibody，HuMAb) 是指完全由人類基因編碼表達的單克隆抗體，已經成為未來抗體發展的主要方向。HuMAb具有更豐富的表位、更低的免疫原性、更長的半衰期、更佳的生物活性，在體內應用中表現良好，如體內診斷、傳染病預防、抗體療法和疾病預后判斷等。HuMAb制備過程中還可發掘出高效或/和廣泛交叉反應的“超級抗體”，其具有治療和預防多種病毒感染及其所致疾病的潛力，包括抗原性高度可變的病毒和新興的或具有大流行潛力的病毒。自SARS-CoV-2引起的新冠肺炎(COVID-19) 疫情爆發以來，全球面臨著巨大的公共衛生安全威脅，診斷試劑、抗病毒藥物和疫苗的研發迫在眉睫，HuMAb制備技術可以為高效建立新型病毒疫情快速響應平臺提供有力的支持。目前，HuMAb的制備主要基于四種技術，分別是轉基因動物、抗體庫展示、單細胞克隆和B細胞永生化 (表1)，各技術可獨立進行或者聯合使用。
通過轉基因動物和抗體庫展示技術制備HuMAb已有諸多臨床轉化的成功實例，但這類抗體不能稱之為真正的全人源抗體。小鼠的免疫系統和人類存在很大差異，抗體的親和成熟、型別轉換與人類有差異，無法代表天然人源抗體庫。抗體庫展示技術利用DNA重組技術將抗體信息展示于特定載體上，由于抗體片段是由分別克隆的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的隨機配對產生的，因此也不能真實反映生理抗體信息。直接從人B細胞中獲得目的抗體是一種高效快捷的方法，因為前期無需抗原制備和免疫過程，且天然的抗體庫比隨機配對的抗體文庫具有更高的敏感性和特異性，從受感染者中制備的HuMAb可以提供有關人抗體表位的信息，這些表位對于疫苗的開發以及潛在的治療應用至關重要。雖然抗體庫展示、單細胞克隆和B細胞永生化技術均可利用人B細胞獲得HuMAb，但三者差異明顯。抗體庫展示技術的主要局限如前所述，單B細胞克隆需要先進行繁瑣的抗體異源重組表達后才可進行鑒定篩選，B細胞永生化可先進行功能鑒定，直接對抗原特異性陽性的細胞池進行克隆化，與前者相比目的性更強、工作量小、篩選周期更短。綜上，與傳統方式相比，人B細胞產生的天然抗體經過人類免疫系統選擇，是HuMAb的最佳來源，而B 細胞永生化則是獲得HuMAb的潛在有效方法。通過B 細胞永生化技術獲得的單克隆抗體在生產制備和應用方面具有以下優勢：4) 可以從受感染者中獲得針對未知抗原的抗體，應對突發疫情。離體培養B細胞使其有效增殖和活化是獲得天然人源抗體最直接的方式，然而由于B細胞的數量少、分泌抗體量不足以及體外培養存活時間短、僅能進行有限增殖等問題，限制了下游鑒定和分離操作的進行。目前，B細胞永生化方法主要有人類B細胞雜交瘤技術、EBV轉化、慢病毒介導的遺傳修飾以及CD40L聯合多種細胞因子的體外誘導培養等(圖1)，各方法可單獨或并行使用。
將B細胞與骨髓瘤細胞融合是獲得分泌抗體的永生化B細胞最常用的方法。早期通過利用人B細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合獲得人-鼠異源性雜交瘤細胞，但因建立細胞株困難而產量低，且在傳代過程中很可能丟失某些人類染色體，存在不穩定性。研究者們廣泛探索了可替代的融合伴侶細胞，這些融合伴侶細胞主要有鼠-人嵌合型骨髓瘤細胞系、人骨髓瘤細胞、人骨髓瘤細胞衍生細胞系和人淋巴母樣細胞系。但是用這類融合伴侶細胞產生的人-人雜交瘤細胞不能有效兼顧產量和穩定性需求，且雜交瘤產生的免疫球蛋白的類型受親代細胞特性的強烈影響，因此獲得的雜交瘤分泌的抗體類型單一。影響融合效率的另一個重要因素是融合方法，傳統的PEG融合法操作簡單、成本低，但是效率低下；電融合是最適合產生雜交瘤的方式，但是電融合易導至大量的細胞死亡。目前人類雜交瘤技術的相關方法存在著融合效率低、亞克隆易丟失、工作量大、抗體產量低等缺陷，應用于人類抗體的產生極為困難，無法成為挖掘人類抗體庫的首選方法。端粒是保持染色體的完整性和控制細胞分裂周期的重要結構，端粒維持機制可以抵消DNA復制過程中端粒縮短以及由此引發的DNA損傷反應、細胞周期停滯和凋亡，EBV基于端粒維持機制的激活而使宿主細胞永生化。在EBV誘導B細胞永生化的早期和晚期，端粒酶依賴和非依賴的端粒維持通路在感染細胞中都被激活。利用EBV轉化的方法，研究者已成功獲得了鑒定識別HIV、H1N1流感病毒、H5N1流感病毒、RSV、SARS-CoV和DENV的人類中和單抗。此外，有研究報道在未發生淋巴瘤的HBV慢性感染患者的PBMC中建立了具有無限增殖潛力的B細胞，另有研究發現SV40可有效感染人B細胞并明顯延長其體外存活時間(觀察至100天)，這些則提示了SV40、HBV感染可能成為轉化B細胞永生化的潛在方法。病毒一般僅感染特定的宿主細胞，使用EBV介導的B細胞永生化效率低，需要篩選大量的B細胞以獲得具有所需特異性的非常罕見的B細胞克隆，且B細胞的長期生長和永生化可能與染色體畸變有關，細胞在基因突變過程中往往伴隨細胞表型的改變，如發生腫瘤細胞轉化、細胞生長停滯，抑或是傳代過程中表現出染色體的不穩定性，這均導至難以進行B細胞單克隆化篩選。不僅如此，用于生成體內應用抗體的細胞不能含EBV和其他人類病毒，基于病毒轉化的人類抗體的分離純化難度更高。
